CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
* Tách chiết ADN tổng số: sinh khối vi tảo Thalassiosira sp. được nuôi c y trong môi ấ trường lỏng đến pha log sao cho OD680 đạt 0,5 0,8, sau đó được li tâm và thu tế bào. - ADN tổng số của Thalassiosira sp. được t ch chiá ết theo k t ZR Plant/Seed ADN Mini í Prep của h ng Thermo Scientific, Mã ỹ. Sinh khối vi tảo Thalassiosira sp. được nghi n ề
trong Nitơ lỏng sau đ được đưa vó ào ống c chó ứa các hạt Lysis ZR Bashing BeadTM .và b ổsung dung dịch Lysis Buffer. ADN tổng sốnhanh chóng được t ch ra m không cá à ần s dử ụng c c chất khử ữu cơ hoặá h c proteinase. Polysaccharide và polyphenols được lo i ạ
khỏi ADN tổng sốnhờ ử ụ s d ng cột làm sạch như Zymo - Spin IIC và Zymo Spin™ - IV - HRC. ADN tổng sốthu được sẽđược rửa và làm sạch nhờdung dịch Wash Buffer Hàm .
lượng và chất lượng của ADN tổng số của mẫu vi tảo được đo ở các bước sóng 260 và 280 nm trên máy quang phổ (Nanno Drop) và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. ADN tổng số thu được đảm bảo yêu cầu để làm khuôn thực hiện các phản ứng
PCR tiếp theo. Chi ti t các bưế ớc t ch chiá ết ADN tổng s ốđược tr nh b y ởì à Ph lụ ục 3.
* Phản ứng PCR nhân một phần gen 18S rRNA: dựa trên tr nh tì ự gen 18S rRNA của các lo i thuà ộc chi Thalassiosira được công bốtrên GenBank, chúng tôi đã s dử ụng cặp mồi Primer F v Primer R [108] do Ph ng Công nghệ ảo, Viện Cơng nghệà ị T sinh học thiết k ế đểnhân một phần gen 18S rRNA của m u ẫ Thalassiosira nósp. i trên. Kích thước d ự
kiến thu được là 1.100 bp, bắ ầt đ u từ ị v í tr khoảng 290 bp và kết th c ú ở ị v í 1.tr 330 bp trên gen 18S rRNA (t y theo tù ừng loài thuộc chi Thalassiosira). Chi tiết các bước tiến
hành được trình b y à ởPhụ ụ l c 3.
* Điện di trên gel agarose: sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8% và quan sát dưới đèn tử ngoại (Phụ lục 3).
* Tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng các cột tinh sạch, trên cột này được gắn các hạt có vai trị giữ lại phân tử ADN khi chúng đi qua nhờ liên kết thuận nghịch. Sau đó, sử dụng các dung dịch bám màng và rửa màng để loại bỏ các tạp chất bám trên phân tử
ADN. Sản phẩm PCR được tinh sạch theo Gene JET Purification Kit của hãng Thermo Fisher Scientific được trình bày ở Phụ lục 3.
* Xác định trình tự gen: một phần gen 18S rRNA (Phụ lục 3)được xác định trình tự nucleotide trên máy đọc trình tự tự động (ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, -
USA) bằng cách sử dụng bộ hóa chất chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệViệt Nam.
Các chương trình phần mềm chuyên dụng như ClustalX 1.81, DNASTAR, MEGA7 và BLAST được sử dụng cho phân tích, so sánh và xây dựng cây phát sinh chủng loại của
Thalassiosira pseudonana. Chi tiết sử dụng các phần mềm trong nghiên cứu được trình bày ở Phụ lục 3.