CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Xác định điều kiện ni cấy thích hợp Thalassiosira pseudonana ở quy
quy mơ phịng thí nghiệm và pilot
Lồi Thalassiosira pseudonana được lưu giữ theo hướng dẫn được tham khảo trong cuốn sách “Algal culturing techniques” của tác giảAndersen 2005 ( ) [1 ]12 và có một số
cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng th nghiệm của Việt í Nam [113].
Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng củaThalassiosira pseudonana
ở quy mơ phịng thí nghiệm(0,25 2 L) và quy mô pilot - bể composite (0,2 - 3,5 m3).
+ Bố trí thí nghiệm:
a. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường AGP lên sự phát triển của
Thalassiosira pseudonanaở bình thủy tinh 0,25 2 L gồm có 5 công thức lần lượt là môi -
trường AGP 5, 10, 15, 20 và 25% dưới đ u kiện nhưiề : độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, 25oC, độ kiềm 150 180 mg CaCO3/L - và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. Môi trường AGP được pha loãng cung cấp 1 mL/L và bổ sung silicate 2 mL/L.MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL.
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau lên sự phát triển của
Thalassiosira pseudonanaở bình thủy tinh (0,25 2 L- ) và bể composite 0,2 m3 có 5 cơng
thức lần lượt là môi trường AGP 20%, F2, TMRL, Conway và Walne. Các loại mơi trường được pha lỗng theo cơng thức cho sẵn(bảng 2.1), cung cấp 1 mL/L và bổ sung
silicate 2 mL/L. Điều kiện mơi trường thí nghiệm: 30‰, pH 7,0, 5,0 - 6,0 kluxvới chu kỳ
quang sáng : tối 12 : 12 giờ, 25oC, độ kiềm 150 180 mg CaCO3/L - và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vơ khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL.
c. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu khác nhau lên sự phát triển của
Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh (0,25 2 L) và bể composite (0,2 - - 3,5 m3)
được bố trí với 5 cơng thức lần lượt là 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 và 0,3 x 106tb/mL. MĐTB được quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần và lựa chọn kỹ thông qua các thông số như MĐTB ổn định, cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, góc của tế bào khơng có dấu hiệu gãy góc, khơng bị vón cục, kết dính, khơng tạo thành từng hàng, cụm dày đặc và có màu sắc đặc trưng của tảo và đảm bảo độ đồng đều cao giữa các MĐTB ban đầu đem thí nghiệm, tiến hành pha loãng MĐTB ban đầu theo các nghiệm thức đã chọn nói trên. Điều kiện mơi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 - 10,0 klux
với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, 25oC, độ kiềm150 180 mg CaCO3/L - và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vơ khuẩn.
d. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana
ở bình thủy tinh 0,25 2 L bao gồm 5 công thức l- ần lượt là 15, 20, 25, 30 và 35oC. Sử dụng máy điều hịa 2 chiều cơng suất lớn để điều chỉnh nhiệt độ và sử dụng hệ thống tủ container có dải nhiệt độ (-40oC đến 50oC) để bố trí thí nghiệm ở 15oC. Dùng nhiệt kế thủy ngân (0 - 100oC) để kiểm tra nhiệt độ cho các lô thí nghiệm với tần suất 2 lần/ngày, đơn vị tính là oC. Điều kiện mơi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, 30‰, pH 7,0,
5,0 klux với chu kỳquangsáng : tối 12 : 12 giờ, 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vơkhuẩn MĐTB ban đầu: 0,2 x 10. 6tb/mL.
e. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng khác nhau lên sự phát triển của
Thalassiosira pseudonanaở bình thủy tinh (0,25 2 L) và bể composite (0,2 - - 3,5 m3) bố trí với 5 cơng thức lần lượt là 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 và 7,0 klux. Còn ở bể composite 3,5 m3
khoảng cách chiếu sáng của đèn LED(loại 240 W) từ 40 - 130 cm để điều chỉnh CĐAS
cho các thí nghiệm nói trên và cố định chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ. Đối với bể
composite 3,5 m3, tăng độ sáng tối đa của đèn LED lên và giảm khoảng cách xuống mặt nước của bể nuôi và mặt đèn LED chiếu sáng khoảng 40 cm để thu được CĐAS 12 klux.
Tương tự, nâng khoảng cách 60 cm thu được CĐAS 10,0 klux; khoảng cách 80 cm thu được CĐAS 8,0 klux; khoảng cách 1 m thu được CĐAS 6,0 klux và khoảng cách 1,2 m thu được CĐAS 4,0 klux. Khoảng cách giữa các bể thí nghiệm là 2 m và sử dụng tấm rèm che để tránh bị lẫn ánh sáng giữa các bể thí nghiệm. Đo CĐAS trên bề mặt nước của bể nuôi trồng và được xác định bằngmáy đo ánh sáng(nhãn hiệu Kyoritsu 5202) cóđơn vị tính là klux. Mỗi bể đo 20 điểm để lấy giá trị trung bình của CĐAS được thí nghiệm với tần suất kiểm tra 2 lần/ngày. Điều kiện mơi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, pH 7,0, 25oC, độ kiềm 150 180 mg CaCO3/L - và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vơ khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106tb/mL.
f. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH khác nhau lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonanaở bình thủy tinh 0,25 - 2 L gồm có 6 cơng thức lần lượt là 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 và 9,0. Để giảm độ pH trong mơi trường nước ni của thí nghiệm cần sử dụng đá bọt
CO2 để sục vào và kiểm tra mức độ giảm của pH theo giờ. Để tăng độ pH trong mơi trườngnướcni của thí nghiệm cần sử dụng vơi Ca(OH)2để tạt vào và kiểm tra mức độ tăng của pH theo giờ và giữ ở mức ổn định trong suốt thời gian theo dõi thí nghiệm. Vơi
Ca(OH)2 trước khi cung cấp vào cần được pha loãng với nước rồi chờ lắng mới sử dụng,
cần tiến hành tỉ mỉ, cẩn thận để kiểm soát pH ổn định như thí nghiệm đã đặt ra. Kiểm tra pH bằng máy đo pH (pH testr30) có dải pH từ 4 - 10 với tần suất kiểm tra 2 lần/ngày. Điều kiện mơi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, 25oC, 5,0 klux
với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, độ kiềm 150 180 - mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106tb/mL.
g. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủytinh 0,25 - 2 L( ) và bể composite (0,2 - 3,5 m3) có 5 cơng thức lần lượt là 15, 20, 25, 30 và 35‰. Các độ mặn thấp ở 15, 20 và 25‰ thì sử dụng nước ngọt để làm giảm độ mặn và ổn định độ mặn từ 3 4 ngày rồi mới tiến hành đem vào xử lý để bố trí thí -
nghiệm. Đối với độ mặn 35‰ thì sử dụng muối (NaCl) để tăng độ mặn cho thí nghiệm.
Dùng máy khúc xạ kế đo độ mặn (Refractometer) Atago dải 0 100‰ (Nhật Bản) để -
kiểm tra độ mặn trong các thí nghiệm với tần suất kiểm tra 1 lần/ngày, đơn vị tính là ‰. Điều kiện mơi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, 25oC, 5,0 - 10,0 klux với chu kỳ
quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0,độ kiềm 150 180 - mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ
với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vơ khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL.
h. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ kiềm lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh 0,25 2 L bao gồm 7 công thức lần lượt là - 150, 155, 160, 165, 170, 175 và 180 ± 5 mg CaCO3/L. Sử dụng NaHCO3 (Natri bicarbonat) để tăng và CaSO4.2H2O (thạch cao sống) để giảm độ kiềm theo công thức đã chọn cho thí nghiệm. Kiểm tra độ kiềm4 ngày/lần bằng bộ test aqua base của Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam sản xuất để điều chỉnh cho phù hợp với cơng thức thí nghiệm, đơn vị tính là mg
CaCO3/L. Điều kiện mơi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, 25oC,
5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0 và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL.
i. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ sục khí khác nhau lên sự phát triển của
Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh (0,25 2 L- ) và bể composite (0,2 - 3,5 m3)
máy thổikhí GSD GRB 50, ( - loại 3,7KW) để sục và ngắt khí theo giờ đã mặc định cho
các thí nghiệm nói trên. Tốc độ sục khí được đo bằng máy turbine flowmeter (brand: sure
instrument, model: LWGY), đơn vị tính là m3/h. Phương pháp đo: gắn trực tiếp vào ống khí và đọc dữ liệu trên đồng hồ hiển thị số liệu đo, tiến hành ghi chép số liệu tỉ mỉ, cẩn thận đảm bảo chính xác số liệu thu được. Chất lượng khí đã được xử lý hồn tồn vơ khuẩn. Đối với các thí nghiệm ở bình thủy tinh 0,25 L đến bể composite 1 m3 sử dụng dây khí có kích cỡ 4 - 5 mm và đã được xử lý vơ khuẩn. Đối với các thí nghiệm ở bể
composite 3,5 m3, sử dụng hệ thống ống cấp khí có kích cỡ phi 27 với các lỗ khí từ 1 - 1,5 mm để sục từ đáy lên đảm bảo tất cả các điểm trong bể tảonhậnđượcánh sáng đồng đều và đầy đủ. Điều kiện mơi trường thí nghiệm: AGP 20%, 30‰, 25oC, 5,0 10,0 klux -
với chu kỳquangsáng : tối 12 : 12 giờ và pH 7,0. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106tb/mL.
+ Nguồn nước biển dùng chothí nghiệm: mơi trường nước biển sử dụng cho các thí nghiệm được khai thác từ nước biển tự nhiên thuộc thơn Bắc Hịa, xã Ngư Thủy Bắc, huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình. Phương pháp xử lý nước biển: nguồn nước biển được bơm trực tiếp từ biển tự nhiên vào bể lắng(diệt khuẩn bằng ClO2 - Chlorine dioxide 5 - 10 ppm), sau đó lọc bằng hệ thống lọc TD(sử dụng cát để lọc, kích cỡ hạt cát1 - 2 mm). Sau đó cho nước lọc qua hệ thống máy ôzôn (nồng độ O3 từ 0,4 - 0,6 ppm) chuyển vào bể chứa nước kết hợp sục khí 2 giờ để đảm bảo bay hết O3 về 0. Trước khi sử dụng xử lý nước biểnbằng hệ thống máy lọc nước UF - Ultrafiltration (kích thước lõi lọc 0,05 µm).
Nước biển sau khi xử lý được cấp vào bể dự trữ nước để làm thí nghiệm có bổ sung 120 g CaCO3/m3, Na2EDTA 10 g/m3kết hợp sục khí 1 2 giờ để đảo trộn đều các chất bổ sung- .
Chất lượng nước biển ổn định với các điều kiện như: - 25 27oC; pH 7,0 8,0; 30 31‰ và - -
độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L. Phương pháp chuẩn bị nguồn nước biển cho các thí nghiệm được trình bày ở Phụ lục 5.
+ Chuẩn bị nguồn giống tảo T. pseudonana để tiếp giống cho cácthí nghiệm: (1) Nguồn giống tảoT. pseudonanacho các thínghiệm ở quy mơ bình thủy tinh 0,25 L
lấy từ giống ở ống nghiệm 10 mL được cấy bằng cách pha loãng mẫu, tiếp giống theo tỉ lệ 1:2 (v/v). Giống tảo T. pseudonanađược hoạt hóa trước đó trong phịng chuẩn bị giống cấp 1 (từ 5 - 7 ngày) và sanra ống nghiệm Production line sau thời gian2 ngày nuôi cấy với MĐTB tảo giống 0,4 x 10đạt 6tb/mL. Điều kiện nhân giống của ống nghiệm 10 mL: môi trường AGP 20%, 30‰, 5,0 kluxvới chu kỳ sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0, 25oC, 150 - 180 mg CaCO3/L. Chất lượng giống tảo có các cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hồn chỉnh, khơng có tạp chất và có màu sắc đặc trưng của vi tảo này và số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng 20 - 30% (hình 2.1).
(2) Nguồn giống tảoT. pseudonana cho các thí nghiệm ở quy mơ bình thủy tinh 1 L được lấy từ giống trong bình thủy tinh 0,25 L được cấy bằng cách pha loãng mẫu, tiếp giống theo tỉ lệ 1:2 (v/v). Giống tảo được lấy từ bình thủy tinh 0,25 L sau 2 ngày ni cấy với MĐTB tảo giống đạt 0,4 x 106tb/mL. Điều kiện nhân giống của bình thủy tinh 0,25 L: mơi trường AGP 20%, 30 , 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0, ‰ 25oC, 150 - 180 mg CaCO3/L. Chất lượng giống tảo có các cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh và số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng
35 - 40% (hình 2.1).
(3) Nguồn giống tảoT. pseudonana cho các thí nghiệm ở quy mơ bình thủy tinh 2 L lấy từ giống ởbình thủy tinh 1 L được cấy bằng cách pha loãng mẫu, tiếp giống theo tỉ lệ
1:3 (v/v). Giống tảo được lấy từ bình thủy tinh 1 L sau 2 ngày ni cấy với MĐTB tảo giống đạt 0,6 x 106 tb/mL. Điều kiện nhân giống của bình thủy tinh 1 L: mơi trường AGP 20%, 30‰, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0, 25oC, 150 - 180 mg
CaCO3/L, CĐSK 24/24 giờ. Chất lượng giống tảo có các cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh và số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng 30 - 35% (hình 2.1).
Hình 2.1. Quytrình chuẩn bị nguồn giống tảoT. pseudonana
(4)Nguồn giống tảoT. pseudonanacho các thí nghiệm ở quy mơ bể composite 0,2 m3
lấy từ giống ởbình thủy tinh 2 L được cấy bằng cách pha loãng mẫu, tiếp giống theo tỉ lệ
1:3 (v/v). Giống tảo được lấy từ bình thủy tinh 2 L sau 2 ngày ni cấy có MĐTB tảo giốngđạt 0,6 x 106tb/mL. Điều kiện nhân giống ở bình thủy tinh 2 L mơi trường: AGP
2 ngày nuôi 2 ngày nuôi 2 ngày nuôi 2 ngày nuôi (5) (3) (2) (1) (4)
Chuẩn bị giống tảo
T. pseudonana AGP 20%, 30‰, 5,0 klux, pH 7,0, 25oC, 150 - 180 mg CaCO3/L AGP 20%, 30‰, 5,0 klux, pH 7,0, 25oC, 150 - 180 mg CaCO3/L AGP 20%, 30‰, 5,0 klux, pH 7,0, 25oC, 150 - 180 mg CaCO3/L, CĐSK 24/24 giờ AGP 20%, 30‰, 5,0 klux, pH 7,0, 25oC, 150 - 180 mg CaCO3/L, CĐSK 24/24 giờ AGP 20%, 30‰, 6,0 klux, pH 7,0, 25oC, 150 - 180 mg CaCO3/L, CĐSK 24/24 giờ AGP 20%, 30‰, 6,0 klux, pH 7,0, 25oC, 150 - 180 mg CaCO3/L, CĐSK 24/24 giờ (6) 2 ngày nuôi
20%, 30‰, 5,0 kluxvới chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0, 25oC, 150 - 180 mg CaCO3/L, CĐSK 24/24 giờ. Chất lượng giống tảo có các cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh và số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng 20 -
25%, kích thước tế bào ổn định từ 4 - µm 5 (hình 2.1).
(5) Nguồn giống tảoT. pseudonanacho các thí nghiệm ở quy mô bể composite 1 m3
lấy từ giống trong bể composite 0,2 m3được cấy bằng cách pha loãng mẫu, tiếp giống theo tỉ lệ 1:2 (v/v) Giống tảo được lấy từ bể composite 0,2 m. 3sau 2 ngày nuôi cấy với MĐTB tảo giống đạt 0,4 x 106 tb/mL. Điều kiện nhân giống của bể composite 0,2 m3:
môi trường AGP 20%, 30‰, 6,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0,
25oC, 150 180 mg CaCO- 3/L, CĐSK 24/24 giờ. Chất lượng giống tảo có các cụm tế bào
và tế bào đồng đều, đẹp, tế bào hoàn chỉnh và số lượng tế bào đang ở giai đoạn phân chia tế bào khoảng 10 15%, kích thước tế bào ổn địn- h từ 4 - 5 µm (hình 2.1).
(6) Nguồn giống tảoT. pseudonanacho các thí nghiệm ở quy mơ bể composite 3,5 m3
lấy từ giống ở bể composite 1 m3được cấy bằng cách pha loãng mẫu, tiếp giống theo tỉ lệ
1:2 (v/v). Giống tảo được lấy từ bể composite 1 m3sau 2 ngày ni cấy có MĐTB tảo giống đạt 0,4 x 106tb/mL. Điều kiện nhân giống ở bể composite 1 m3: môi trường AGP