CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.3 Nghiên cứu lưu giữ, khả năng sinh sản và sinh trưởng của Thalassiosira
Thalassiosira pseudonana
Hiện nay, để chủ động cung cấp nguồntảo giống chất lượng và ổn định tại chỗ cho các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng. Có nhiều phương pháp lưu giữ giống vi tảo
Thalassiosira pseudonana trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau. Tuy nhiên, chúng
tôi đã lưu giữ giống T. pseudonana trên môi trường dinh dưỡng AGP 20% ở đĩa thạch agar và môi trường lỏng trong các ống nghiệmđể có nguồn tảo giống cung cấp ổn định.
3.1.3.1. Lưu giữ Thalassiosira pseudonana ở nhiệt độ phòng
Trong điều kiện phịng thí nghiệm của trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng, Thalassiosira pseudonana sau khi được nhân giống ổn định từ các đĩa tảo gốc và tảo được phân lập làm sạch lại từ mẫu nhiễm, chúng được nuôi trong môi trường AGP % 20
lỏng, sau đó tiến hành lưu giữ giống trên môi trường lỏng và môi trường thạch (0,8 -
1,5% agar). Kết quả lưu giữ giống T. pseudonanatrong môi trường lỏng được minh họaở
hình 3.5.
Hình 3.5. Thalassiosira pseudonana (A, B)trong mơi trường lỏng
Kết quả trình bày ở trên hình 3.5 minh họa cho việc lưu giữ thành cơng lồi T. pseudonana trong môi trường lỏng ở nhiệt độ 8 - 12oC (tủ lạnh) cung cấp ánh sáng 200 ,
lux, thời gian bảo quản từ 3 - 4 tháng với chu kỳ cấy chuyển 1 - 2 tuần/lần và giữ ở cả 3 đợt cấy chuyển liên tiếp (3 thế hệ). Vi tảogiống sau khi cấy chuyển sẽ được theo dõi hình thái tế bào, sinh trưởng và thời gian cần cấy chuyển. Giữ giống T. pseudonana trong mơi trường lỏng có ưu điểm dễ tiến hành và có khả năng hoạt hóa mẫu nhanh. Tuy nhiên, do
phải cấy chuyển thường xuyên nên khả năng mẫu bị nhiễm khuẩn, nhiễm chéo có nguy cơ rất lớn, ngồi ra tốn diện tích lưu giữ, mơi trường ni, thời gian và cơng sức khi cấy chuyển. Vì vậy, để khắc phục và đảm bảo cung cấp nguồn giống ổn định lâu dài, chúng tôi tiến hành lưu giữ giống vi tảonày trên mơi trường thạch đặccó bổ sung 0,8 - 1,5%
agar. Kết quả lưu giữ giống T. pseudonana trên mơi trường thạch đặc có bổ sung agar được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3.6. Đĩa thạch (A, B) và khuẩn lạc của pseudonana (C, D) T. trên môi trường thạch
agar
Đối với T. pseudonana đã lưu giữ thành cơng trong điều kiện phịng thí nghiệm sẽ tiếp tục được nuôi trên môi trường thạch đặc Sau khi nuôi ở đĩa petri với thời gian từ 7 . - 14
ngày, tiến hành kiểm tra dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần thấy các khuẩn lạc đã phát triển đầy đủ (hình 3.6), dày kín bao phủ bề mặt của đĩa thạch, gói kín bằng giấy bạc cho các đĩa được chọn để đem bảo quản, dùng hộp có nắp đậy kín đem các đĩa petri đã được gói và đóng kín lại, sau đó đem bảo quản trong tủ lạnh ở ngăn mát giữ
nhiệt độ ổn định từ 8 - 12oC, không cung cấp ánh sáng, thời gian bảo quản từ 6 - 12 tháng. Sau 6 - 12 tháng bảo quản, tiến hành cấy chuyển sang đĩamới để sàng lọc, lưu giữ liên tục giúp chọn lọc lại giống tảo đẹp.
Trước khi sử dụng các ống nghiệm và đĩa petri được bảo quản ở trên cần đem mẫu ra để ở ánh sáng phòng với thời gian 3 - 5 giờ, cấy chuyền 2 lần rồi mới sử dụng. Kiểm tra nhiệt độ bảo quản hàng ngày, ghi chép tỉ mỉ để kiểm soát nhiệt độ bảo quản.
3.1.3.2. Đặc điểm sinh học sinh sản của halassiosiraT pseudonana
Trong điều kiện thí nghiệm này tả, o giốngThalassiosira pseudonana được nuôi trong ống nghiệm đã được gây sốc đột ngột bằng nhiệt độ (giảm nhiệt độ xuống 2 - 8oC), đưa thêm môi trường từ 1 mL ( AGP 20% cho 1 L môi trường được tăng lên 5 - 7 mL AGP/L)
kết hợp giữ nguyên điều kiện chiếu ánh sáng. Tuy nhiên, tỉ lệ thành công trong việc cho vi tảo này sinh sản bằng cách hình thành bào tử sinh trưởng là rất hạn chế. Trong quá
trình nghiên cứu, chúng tơi đã sử dụng các bào tử sinh trưởng của T. pseudonana để thực
hiện cấy chuyển sang các ống nghiệm khác (Phụ lục 8) để tiếp tục nhân giống khi kích
thướcgiốngbị đột biến và chất lượng tảo bị giảm xuống sau thời gian dài nuôi sinh khối ở các quy mơ. Kết quả của nghiên cứu được trình bày ở trên hình 3.7.
Hình 3.7. Bào tử sinh trưởng của T. pseudonana ở ống nghiệm.
A: các tế bào có dấu hiệu hình thành nhân của tế bào con, B: các tế bào con có nhân tăng lên chuẩn bị phân chia, C: các tế bào con phân chia thành tế bào mới
Các tế bào đặc biệt này ở ống nghiệm có nhân rõ ràng và có dấu hiệu sắp phân chia. Bào tử sinh trưởng khơng quan sát thấy trên đĩa thạch mặc dù đã tiến hành nhiều lần thí nghiệm lặp lại và khơng thành cơng. Kết quả thu nhận được cho thấy T. pseudonana rất đặc biệt trong hình thức sinh sản này. Ngược lại, dưới điều kiện môi trường thay đổi nêu
trên chỉ thu được các tế bào có hình dạng bình thường (hình 3.7A), đã hình thành các nhân của tế bào con ở bên trong tế bào bố mẹ và các tế bào đã có nhân tăng lên chuẩn bị phân chia thành tế bào mới (hình 3.7B, C).
3.1.3.3. Sinh trưởng của halassiosiraT pseudonana
Với khảo sát sơ bộ, chúng tôi nhận thấy trong các quy mơ ni trồng Thalassiosira
pseudonana khác nhau thì ở quy mơ bình thủy tinh 1 L cho kết quả về mật độ tế bào đạt
cực đại cao, tế bào vi tảo đẹp, độ đồng đều cao và ổn định. Do đó, chúng tơi đã chọn quy mơ ni này để nghiên cứu đường cong sinh trưởng của chúng sau 14 ngày nuôi cấy. Kết
quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của T. pseudonana sau 14 ngày nuôi cấyở quy mơ bình thủy tinh 1 L được trình bày trên hình 3.8.
Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng của T. pseudonana sau 14 ngày ni cấy ở bình thủy tinh 1 L. Ghi chú: Lô thử nghiệm: T. pseudonana; Lô đối chứng: T. weissflogii
Trong thí nghiệm này, chúng tơi đã sử dụng T. weissflogii làm lô đối chứng để xác định đường cong sinh trưởng của loài đối chứng và lồi nghiên cứu. Bởi vì, hiện nay T.
weissflogii đang được ni trồng rất ổn định và có hiệu quả kinh tế cao trong tất cả các trại sản xuất giống TTCT với quy mơ bình thủy tinh 0,25 - 2 L và bể composite 0,2 - 3,5 m3 sẽ được sử dụng làm một số công thức đối chứng cho nghiên cứu của chúng tơi khi thí nghiệm với T. pseudonana.
Kết quả nghiên cứu được chỉ ra trên hình 3.8 đã cho thấy MĐTB cực đại của T. pseudonana đạt cao hơn (1,59 ± 0,05) x 106 tb/mL so với công thức đối chứng
(Thalassiosira weissflogii - (1,11 ± 0,03) x 106 /tb mL . Tuy nhiên, thời gian MĐTB đạt )
cực đại của loài T. pseudonana là 6 ngày (tương tự như ở công thức đối chứng) nhưng MĐTB đạt cực đại có sự sai khác về mặt thống kê sinh học (p<0,05).
3.2. Điều kiện nuôi sinh khốiThalassiosira seudonana p ở các quy mô
khác nhau
Hiện nay, các hướng nghiên cứu về công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonanađã được
công bố khá rõ ràng trên thế giới. Tuy nhiên, khả năng thích nghi của mỗi lồi vi tảo lại phụ thuộc rất nhiều vào nguồn gốccủa giống, vùng địa lý nuôi trồng, nguồn nước biển sử dụng cho hệ thống nuôi, môi trường dinh dưỡng và các điều kiện môi trường khác.
Ở các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng của chúng tôi đang sử dụng môi trường AGP với tỉ lệ 20% để nuôi Thalassiosira weissflogii cho năng suất sinh khối cao (đánh giá thông qua MĐTB đạt cực đại và tốc độ sinh trưởng đặc trưng , chất lượng vi tảo ) ổn định, giá trị kinh tế cao gấp 5 lần so với sinh khối tươi sống được nuôi bằng các loại môi
trường khácnhư F/2, Walne…. Thành phần dinh dưỡng của môi trường AGP 20%chứa rất nhiều chất dinh dưỡng vơ cơ gồm có nguồn đạm (chủ yếu là muối Na2NO3), nguồn
lân là muối H2PO4-của K hoặc N, nguồn silic là muối Na2SiO3, muối Fe3+, các khoáng
chất vi lượng như Fe, Mn, Cu, Co… các vitamin A, B1, B2, B3, B6, B12. Ngồi ra, mơi
trường này chiếm 2 thành phần chính là phốtpho và Nitơ giúp kích thích tăng trưởng và phân chia tế bào nhanh chóng. Hơn nữa, với tỉ lệ môi trường này chúng tôi khơng thấy hiện tượng dư thừa mơi trường vì vi tảo đã hấp thu và sử dụng hết dinh dưỡng có trong mơi trường được cung cấp trong cùng thời gian ni và khơng gây ơ nhiễm thứ cấp có hại cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng khi sử dụng chúng làm nguồn thức ăn tươi sống ở giai đoạn zoea.
Chính vì vậy, chúngtơi đã tiến hành xác định ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường AGP
từ 5 - 25% cho các quy mô nuôi trồng T. pseudonana thông qua giá trị trung bình của MĐTB đạt cực đại và tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ/ngày). Ngồi ra các yếu tố khác như MĐTB ban đầu 0,2 x 106tb/mL, nhiệt độ 25oC, CĐAS 5,0 - 10klux, pH 7,0, độ mặn
30‰, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ là các điều kiện thích hợp đang được áp dụng để nuôi đại trà T. weissflogiiđạt ổn định và cho năng suất caocũng sẽ được rà soát để áp dụng cho các thí nghiệm đối với T. pseudonana nhằm bảo đảm mục tiêu xem xét điều kiện ni trồng hiện nay đối với lồi T. weissflogii có phù hợp vớilồi T. pseudonana ở quy mơ ni trồng khác nhau trong phịng thí nghiệm (0,25 - 2 L) và pilot (0,2 - 3,5 m3) hay khơng.
3.2.1. Đ ềi u kiện thích hợp để nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở
quy mơ phịng thí nghiệm 3.2.1.1. Quy mơ bình thủy tinh 0,25 L
a. Ảnh hưởng của tỉ lệ %mơi trường AGP
Hiện nay, có nhiều loại mơi trường dinh dưỡng có thể sử dụng để ni sinh khối các lồi vi tảo khác nhau. Vi tảo Thalassiosira pseudonanađã được nuôi thành công trong các loại môi trường khác như môi trường F/2, TMRL, Conway và Walne, tuy
nhiên, sinh khối thu được còn hạn chế so với tiềm năng sinh trưởng của sinh khối T. pseudonana. Môi trường AGP là sản phẩm đã được thương mại hóa, giàu dinh dưỡng có thể cung cấp đủ dưỡng chất cho sinh trưởng và phát triển của T. pseudonana và
bảo đảm độ ổn định và tiện dụng của mơi trường ni. Đặc tính của mơi trường này là dạng đậm đặc ngun chất, do đó, chúng tơi phải tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường AGP từ 5 - 25% để có thể chọn được tỉ lệ % mơi trường AGP sao
cho thích hợp nhằm thu được sinh khối cao với chi phí sản xuất thấp nhất. Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường dinh dưỡng AGP lên sinh trưởng của
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường AGP lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy
Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d trong cùng thời điểm thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05).
Kết quả được trình bày ở hình 3.9 cho ta thấy sau 14 ngày nuôi cấy, sinh trưởng của T. pseudonana trong mơi trường có tỉ lệ % mơi trường AGP là 20% (µ = 0,30/ngày), tương ứng mật độ tế bào đạt cực đại là (1,20 ± 0,05) x 106 tb/mL ở ngày nuôi thứ 6. Sự sai khác
về MĐTB giữa các cơng thức thí nghiệm có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (p<0,05).
Do vậy, tỉ lệ % môi trường AGP là 20% được chọn là tỉ lệ % mơi trường AGP thích
hợp cho T. pseudonana ở bình thủy tinh 0,25 L và tỉ lệ % môi trường này đã được chọn
cho các thí nghiệm tiếp theo.
Ở quy mơ này, khi sử dụng tỉ lệ % môi trường AGP lên đến 25% thì có hiện tượng dư thừa mơi trường (dấu hiệu để nhận biết dư thừa mơi trường trong dịch ni có các cặn bẩn lơ lửng, tạo bọt và nổi thành váng trên bề mặt của thiết bị ni trồng), cịn ở các mức <15% thì xảy ra hiện tượng màu sắc của tế bào kém và nhạt dần sau 6 ngày ni. Do vậy,
T. pseudonana có khả năng sử dụng hết mơi trường AGP với tỉ lệ 20%, chúng an tồn khơng gây ô nhiễm thứ cấp do dư thừa dinh dưỡng của môi trường nuôi và sử dụng nguồn nitơ có trong mơi trường này hồn tồn phù hợp với cơng bố của Stramski và cộng sự (2002) [124], Berges và cộng sự (2002) [125], Bucciarelli và Sunda (2003) [126].
b. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng
Để nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau lên sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana, chúng tôi đã tiến hành khảo sát các môi trường dinh dưỡng AGP 20%, F/2, TMRL, Conway và Walne để lựa chọn mơi trường thích hợp cho sinh trưởng của T. pseudonana ở bình thủy tinh 0,25 L. Đây là mức tăng sinh khối đầu tiên trong công nghệ nuôi T. pseudonana để sản xuất nguồn tảo giống có chất lượng tốt và sinh trưởng nhanh cho các cấp độ tiếp theo. Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khác nhau lên sinh trưởng của T. pseudonana được trình bày trên
Hình 3.10. Ảnh hưởng của mơi trườngkhác nhaulên sinh trưởng của T. pseudonana
có MĐTB đạt cực đại trong bình thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày ni cấy
Ghi chú: Các chữ cái a, b, c trong cùng thời điểm thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05).
Kết quả được trình bày ở trên hình 3.10 cho thấy sau 14ngày ni cấy trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau, sinh trưởng của T. pseudonana ở môi trường AGP 20% (µ
= 0,23/ngày), có mật độ tế bào đạt cực đại là (1,23 ± 0,04) x 106 tb/mL ở ngày nuôi thứ 6. Sinh trưởng của vi tảo này trong môi trường AGP 20% so với các mơi trường cịn lại có sự sai khác về mặt thống kê sinh học (p<0,05). Tuy nhiên, giữa môi trường F/2 và Walne khơng có sự sai khác về mặt thống kê sinh học (p>0,05).
Nghiên cứu của Hoffmann và cộng sự (2012) [127] đã cho thấy rằng T. pseudonana có
khả năng sinh trưởng ổn định và phát triển rất tốt trên môi trường F/2 trong suốt thời gian nuôi trồng. Kết quả thu được của chúng tôi cho thấy vi tảo nói trên cũng sinh trưởng và phát triển khá tốt trong các môi trường F/2, TMRL, Conway và Walne. Tuy nhiên, phương pháp pha lỗng các mơi trường này rất phức tạp, tốn kém thời gian, khó đáp ứng cho sản xuất đại trà trong các trại sản xuất giống tơm thẻ chân trắng có quy mơ lớn so với mơi trường AGP 20% (sản phẩm đã được thương mại hóa, giá thành rẻ; không bị dư thừa dinh dưỡng trong môi trường nuôi khi sử dụng sản phẩm làm thức ăn tươi sống cho ấu
trùng TTCTở giai đoạn zoea; tế bào tảo đồng đều, đẹp, màu sắc của dịch nuôi cấy đẹp và khơng có hiện tượng gây ơ nhiễm thứ cấp Kết quả nghiên cứu thu được MĐTB đạt cực ).
đại cao và thời gian đạt cực đại sớm hơn 2 ngày khi nuôi chúng ở môi trường AGP 20% so với các môi trường khác. Kết quả của chúng tơi hồn tồn phù hợp với cơng bố của Hoffmann và cộng sự (2012) [127]. Chính vì vậy, mơi trường AGP 20% làmơi trường thích hợp đã được chọn để ni sinh khối T. pseudonana trong bình thủy tinh 0,25 L.
c. Ảnh hưởng của mật độtế bàoban đầu
Mật độ tế bào ban đầu của Thalassiosira pseudonana ảnh hưởng đến khả năng đạt cực đại và thời gian đạt cực đại trong các hệ thống nuôi trồng khác nhau. Kết quả nghiên cứu
về ảnh hưởng của MĐTB ban đầu lên sinh trưởng của T. pseudonanađược chỉ ra ở trên
hình 3.11.
Hình 3.11. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của T. pseudonana có
MĐTB đạt cực đại ở bình thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy
Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d trong cùng thời điểm thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05).
Kết quả được trình bày ở hình 3.11 cho ta thấy sinh trưởng của T. pseudonana ở MĐTB ban đầu 0,2 x 106tb/mL (µ = 0,20/ngày) có, MĐTB đạt cực đại (là 1,30 ± 0,04 x ) 106tb/mL tại ngày nuôi thứ 6. Sự sai khác về sinh trưởng của tảo ở các lơ thí nghiệmsau