CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.2. Định tên khoa học Thalassiosira sp bằng kỹ thuật đọc và so sánh trình
trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA
Dựa trên các đặc điểm hình thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi LM và SEM, chúng tơi đã sơ bộ kết luận hình thái tế bào của Thalassiosira sp. ni trồng giống với hình thái tế bào của Thalassiosira pseudonana Hasle và Heimdal (1970). Tuy nhiên, do
kích thước tế bào của lồi nêu trên bé từ 4 - 5 µm. Vì vậy việc quan sát các đặc điểm ,
hình thái dưới kính hiển vi LM và SEM có thể chưa chính xác. Ngồi ra, đặc điểm hình thái của tế bào vitảo có thể thay đổi dưới điều kiện mơi trường ni trồng khác nhau. Do đó, chúng tơi thấy cần thiết phải sử dụng kỹ thuật đọc và so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA để xác định tên khoa học chính xác của Thalassiosira sp..
* Tách chiết ADNtổng số
ADN tổng số củ mẫua Thalassiosira sp. được tách chiết theo mơ tả của Hồng Thị Lan
Anh và cộng sự (2010) [108 . Kết quả tách chiết ADN được trình bày trên hình 3. A. Kết ] 3
quả xác định nồng độ (Phụ lục 3) và độ sạch của ADN bằng cách đo OD (optical
density) ở bước sóng 260 và 280 nm trên máy UV 1601 và - điện di trên gel agarose
0,8% cho thấy ADN tổng số thu được là một băng gọn, sáng và khơng bị đứt gãy với kích thước tương ứng khoảng 21 kb, đạt chất lượng (OD260/280 >1,8) cho phép sử dụng
chúng cho các thí nghiệm tiếp theo.
* Khuếch đại đoạn gen 18S rRNA của Thalassiosira sp.
Đoạn gen 18S rRNA của Thalassiosira sp. được khuếch đại nhờ phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Prime F - R theo công bố của Hoàng Thị Lan Anh và cộng sự (2010) [108] Theo tính tốn lý th. uyết, sản phẩm PCR sẽ có kích thướ khoảngc là 1,1 kb. Kết quả trình bày ở hình 3.3B cho thấy sản phẩm PCR thu được có một băng ADN có kích
thước khoảng1,1 kbđúng như tính tốn lý thuyết.
Để giảm thiểu các tín hiệu gây nhiễu trong quá trình đọc trình tự, chúng tôi đã tiến hành thôi gen và tinh sạch sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR được làm sạch và thu bằng Gene JET Purification Kit của hãng Thermo Fisher Scientific (hãng Promega - Mỹ). Dịch
ADN sau khi tinh sạch sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% nhằm xác định chất lượng và hiệu suất của quá trình thơi gel (hình 3.3C).
Hình 3.3. ADN tổng số và nhân đoạn gen 18S rRNA của Thalassiosira sp.
A: tách chiết ADN tổng số của Thalassiosira sp.(giếng 1); B: nhân đoạn gen 18S rRNA của Thalassiosira sp. bằng cặp mồi Primer F - R (giếng 2); C: sản phẩm PCR chưa tinh sạch
(giếng 3, 4 và 5); D: sản phẩm PCR tinh sạch của Thalassiosira sp.(giếng 6); Giếng M:
Thang ADN chuẩn 1 kb GeneRuler.
Đọc trình tự trên máy ABI PRISM (R) 3100 - Avant Genetic Analyzer (USA) của Viện
Công nghệ sinh học, sử dụng ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit của hãng Perkin - Elmer.
* Trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA của Thalassiosira sp.
Kết quảthu được đượctrình bày ở trên bảng 3.2 và hình 3.4 đã cho thấy oạn gen 18S đ rRNA của Thalassiosira sp. được khuếch đại nhờ cặp mồi đặc hiệu Primer F và R thu được có kích thước 1007 bp.
Bảng 3.2. T ỉ lệ phần trăm (%) độ tương đồng (ma trận tam giác trên) và khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dưới) của đoạn gen 18S rRNA giữa các loài
thu chi Thalassiosira ộc
Sử dụng trình tự gen tương ứng của các loài Phaeodactylum tricornutum (FR744760.1), Stephanopyxis turris (KJ671710.1), Nitzchia pusilla (AJ867015.1) làm
nhóm ngoại - đây là các lồi có quan hệ gần gũi với chi Thalassiosira. Trên cây phát sinh
chủng loại của chi Thalassiosira được chia thành 2 nhánh (hình 3.4), nhánh thứ nhất là
lồi nhóm ngoại P. tricornutum có tỉ lệ tương đồng so với các loài thuộc chi
Thalassiosira dao động từ 71,5% đến 79,9%. Nhánh thứ hai được chia thành 2 nhánh
(AJ867015.1) có tỉ lệ phần trăm tương đồng dao động từ 77,7% đến 91,7% so với các
loài thuộc chi Thalassiosira. Nhánh phụ thứ hai gồm các loài thuộc chi Thalassiosira. Thalassiosira sp. có tỉ lệ phần trăm tương đồng cao nhất với loài T. pseudonana CCAP 1085/12 (KU900218.1) đạt 99,5%, tiếp theo là loài T. delicatula (AJ810855.1) đạt
97,6%, T. tenera (AJ810858.1) đạt 97,3% và thấp nhất là loài T. punctigera (AJ810856.1) đạt 97,1%.
Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại của Thalassiosira sp.dựa trên trình tự gen 18S rRNA
Như vậy, dựa trên những đặc điểm hình thái tế bào tỉ lệ phần trăm tương đồng (bảng ,
3.2), cây phát sinh chủng loại của các loài thuộc chi Thalassiosira (hình 3.4) và so sánh
trình tự nucleotide đoạn gen 18S rRNA (Phụ lục 4) chúng tôi đã định tên khoa học của
Thalassiosira sp. thuộc về lồi Thalassiosira pseudonana. Trình tự đoạn gen 18S rRNA
của vi tảo nêu trên đã được đăng ký trên GenBank với mã số được cấp là MH545685 1..
Lần đầu tiên ở Việt Nam, chúng tơi đã xác định được trình tự đoạn gen 18S rRNA và
định tên khoa học chính xác lồi Thalassiosira pseudonanaphân lập lại từ nguồn giống nhập nội của Thái Lan.