CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.6.1. Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và hành
vi của động vật thực nghiệm sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana
Chúng tơi tiến hành thử độc tínhcấp và giá trị LD50 trên chuột nhắt trắng và độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắngcủa SKK Thalassiosira pseudonanađược xác định theo phương pháp của Litchfield - Wincoxon 19] [1 theo hướng dẫn của Bộ Y tế Việt
Nam [120], hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế [121] và của Tổ chức Y tế thế giới [122] được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu sinh lý bệnh Học viện Quân y-
Việt Nam.
a) Phương pháp đánh giá độc tính cấp trên chuột nhắt trắng
* Phương phápxác địnhmức liều làm chết chuột thí nghiệm (nếu có độc tính):
Cho 2 chuột nhắt trắng đầu tiên uống với liều tối đa có thể hịa tan của Thalassiosira
pseudonana. Theo dõi trong 72 giờ, nếu cả 2 con chuột nhắt trắng chết, pha loãng dần và cho các cặp 2 chuột nhắt trắng uống cho đến khi xác định được mức liều của SKK chỉ
gây chết 1 trong 2 chuột nhắt trắng trong vòng 72 giờ.
* Phương pháp đánh giá độc tính cấp
Sau khi xác định được mức liều của Thalassiosira pseudonana gây chết 1 trong 2 chuột nhắt trắng ừ liều , t này chúng tôi pha thành 6 mức liều (3 mức liều nồng độ cao hơn và 3 mức liều nồng độ thấp hơn) với bước nhảy mức liều nằm trong khoảng 10 - 30%
nồng độ của chế phẩm đem thử nghiệm. Mỗi mức liều cho 10 chuột nhắt trắng uống.
Theo dõi tình trạng chung và số chuột nhắt trắngchết trong vòng 72 giờ. Chúng tôi đã lập bảngtỉ lệ chuột nhắt trắng chết ở các liều và từ đó xác định LD50 của chế phẩm.
Các mức liều thử nghiệm của T. pseudonana đã được xác định ở Phụ lục 15. Trước khi thí nghiệm chuột nhắt trắng nhịn ăn 12 giờ, cho uống nước bình thường. Sau đó, cho chuột nhắt trắng uống chế phẩm với các mức liều tăng dần bằng cách đưa thẳng vào dạ dày bằng kim cong đầu tù.
- Theo dõi động vật thử nghiệm: Theo dõi biểu hiện ngộ độc của chuột nhắt trắng ngay
sau khi uố g trong vòng 1 giờn , tiếp theo sau mỗi 24 giờ, trong vòng 7 ngày sau khi uống, ghi chép chi tiết mọi diễn biến của chuột trong thời gian theo dõi tình trạng chung (vận động, bài tiết,…) và số lượng chuột nhắt trắngchết ở mỗi lô trong 72 giờ và đến hết ngày thứ 7 sau khi uống chế phẩm lần đầu. Tiến hành phân tích tình trạng các tạng ngay sau khi có chuột nhắt trắng chết để xác định nguyên nhân gây độc.
b) Phương pháp đánh giá độc tính trường diễn trên đối tượng chuột cống trắng
Thí nghiệm được tiến hành với 24 chuột cống trắng, được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 8 con, cân nặng dao động từ 200 ± 20 g/con. Chuột cống trắng thí nghiệm được ni trong điều kiện chuồng thống mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của chuột. Chuột được theo dõi ổn định trong vòng 5 - 7 ngày. Chuột đạt tiêu chuẩn thí nghiệm được đưa vào sử dụng.
* Phương pháp nghiên cứu:
Các thử nghiệm được tiến hành với Thalassiosira pseudonanavà được bố trí như sau:
Lô chứng: uống dung dịch NaCl 0,9% tương ứng với liều 1,00 mL/kg trọng lượng cơ thể/ngày.
Lô thử nghiệm1: uống vi tảo liều 100 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày.
Lô thử nghiệm 2: uống vi tảo liều 300 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày.
Chuột được uống dung dịch NaCl 0,9% và T. pseudonana trong 28 ngày liền, mỗi ngày một lần vào buổi sáng. Chuộtđược nuôi trong cùng điều kiện môi trường và cùng chế độ dinh dưỡng cân bằng với thời gian thử nghiệm được tiến hành trong 28 ngày liên tục.
Dựa theo “Nguyên tắc và phương pháp nghiên cứu độc tính” của Hayes (2001) [123], độc tính bán trường diễn của SKK được đánh giá dựa trên các thông số như sau: Sau 14 và 28 ngày thí nghiệm, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu như sau: tình trạng chung, thể trọng của chuột; đánh giá chức năng tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu; đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzyme và chất chuyển hóa trong máu: ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase); đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ ure, creatinin huyết thanh và giải phẫu mô bệnh học: sau 28 ngày uống vi tảo, chuột được mổ để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của ít nhất 30% số chuột ở mỗi lô.
c) Phương pháp nghiên cứu hành vi của động vật thực nghiệm sử dụng sinh khối
Thalassiosira pseudonana
Động vật thực nghiệm là chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe mạnh 10 - 12 tuần tuổi có trọng lượng 20 30 g/con do Ban chăn nuôi động vật của Học viện Quân y cung cấp đã -
được phân nhóm (mỗi nhóm 8 chuột) như sau: Nhóm chứng: uống dung dịch NaCl 0,9%.
Nhóm THP1: uống Thalassiosira pseudonanaliều 100 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày.
Nhóm THP2: uống T. pseudonana liều 150 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày.
Chuột ở các nhóm chứng được uống dung dịch NaCl 0,9% và dung dịch T. pseudonanatrong thời gian 3 tuần liên tiếp. Chúng tôi tiến hành đánh giá thông qua các bài tập môi trường mở, mê lộ chữ Y và nhận thức đồ vật được trình bày ở Phụ lục 17. 2.3.6.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại thức ăn đến tăng trưởng
và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng
* Các chỉ tiêu theo dõi: Tăng trưởng của ấu trùng tôm thẻ chân trắng, thời gian biến thái
Z1 - PL1 vàtỉ lệ sống từ N - PL12.
* Bố trí thí nghiệm:
Ảnh hưởng của loại thức ăn đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng ni trong bể composite 50 L: Thí nghiệm về ảnh hưởng của các loại thức ăn
khác nhau lên nuôi ấu trùng TTCT đã được bố trí với 3 nghiệm thức: Khẩu ph n 1 (KP 1 ầ
phần 2 (KP 2 - công thức đối chứng dương) là tảo tươi Thalassiosira weissflogii+ TATH + Artemia; Khẩu phần 3 (KP 3): là tảo tươi Thalassiosira pseudonana + TATH + Artemia. Mật độ nuôi 150 N/L. Trong đó, lơ đối chứng là KP1, KP2, lơ thử nghiệm là
KP3. ồi L T. weissflogii được nuôi ở bể composite 3,5 m3 trong môi trường AGP 20%, 29 - ‰30 , pH 7,5, 27oC, 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12:12 giờ, độ kiềm CaCO3
150 - 180 mg/L và CĐSK 24/24 giờ. Thu hoạch sinh khối T. weissflogii tươi sống làm thức ăn cho ấu trùng TTCT với tổng sinh khối T. weissflogii tươi sống (khoảng 55 - 58 L
cho 1 bể composite 50 L) và tổng sinh khối T. pseudonana tươi sống (khoảng 55 - 58 L
cho 1 bể composite 50 L). MĐTB của T. weissflogii và T. pseudonanađược sử dụng cho
thí nghiệm này là 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL. TATH được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm thức ăn nhân tạo TNT 100, 200, 300, 400 có các kích cỡ hạt khác nhau.
Thử nghiệm nuôi ấu trùng tôm thẻ chân trắngtrong bể xi măng thể tích 30 m3bằng thức ăn tảo tươi Thalassiosira pseudonana + TATH + Artemia (KP 3):
Thí nghiệm được bố trí với 3 lơ sản xuất, mỗi lơ 4 bể xi măng thể tích 30 m3, mật độ 150 N/L. Các điều kiện khác đượcgiữ ngun như thí nghiệm trên. Chúng tơi đã sử dụng tổng sinh khối Thalassiosira pseudonanatươi sống khoảng 33 - 35 m3cho 1 bể xi măng thể tích 30 m3. MĐTB của T. pseudonana được sử dụng ở thí nghiệm này là 0,025 - 0,03
x 106 tb/mL.
2.3.6.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng
* Bố trí thí nghiệm:
Ảnh hưởng của mật độtơmni đến tăng trưởng và t lệ sống của ấỉ u trùng tôm thẻ chân trắng nuôi trong bể composite 50 L: Thí nghiệm ương ấu trùng TTCT được bố trí
trong bể composite 50 L với các mật độ nuôi ần lượt là l 125, 150, 175, 200 225 và 250 , N/L nuôi dưới điều kiện: 30 - 31‰; - 29 30oC; 180 200 mg CaCO3/ - L và pH 7,9 8,2; - thức ăn sử ụ d ng là tảo tươi Thalassiosira pseudonana+ TATH + Artemia. Chúng tôi đã
sử dụng tổng sinh khối T. pseudonana tươi sống từ 55 - 58 L cho 1bể composite 50 L. MĐTB của T. pseudonana được sử dụng cho thí nghiệm này là 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL.
Thử nghiệm ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi thích hợp đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng trong bể xi măng 30 m3: Thí nghiệm ương ấu
trùng TTCT được nuôi trong bể xi măng 30 m3với các mật độ nuôi đã được lựa chọn lần lượt là 125, 130, 155 và 175 N/L, còn các điều kiện khác được giữ nguyên như thí nghiệm trên. Tổng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống được sử dụng từ 33 - 35 m3 cho 1 bể xi măng thể tích 30 m3. MĐTB của T. pseudonanađược sử dụng ở thí nghiệm này là 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL.
Chế độ chăm sóc và quản lý sức khỏe ấu trùng: Thời gian cho ấu trùng ăn 8 l n/ngày ầ
(xen kẽ gi a artemia và thức ăn tổữ ng h p TNT) vào lúc 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 giờ; ợ
khỏe của ấu trùng và chất lượng nước mà có chế độ cho ăn, siphon và thay nước cho phù hợp với tình hình thực tế sản xuất. Các thơng số về mơi trường trong bể ni được trình bày ởPhụ lục 22.
Bảng 2.2. Chế độ cho ăn ấu trùng tôm thẻ chân trắng
Giai đoạn T(x 10ảo tươi6
tb/mL)
Thức ăn tổng hợp (g/tri u tôm) Nauplii artemia ệ
(cá thể/con tôm/lần) TNT 1 00 TNT 2 00 TNT 3 00 TNT 4 00 Zoea 0,025 0,03- - - - - 1 - 2 Mysis 0,025 30 - - - 3 - 5 Postlarvae PL1 - 50 100 - - - PL2 - 3 - 50 100 - - - PL4 - 8 - - - 50 100 - PL9 12- - - - 50 100 -
Ghi chú: - không cho ăn; tảo tươi được cấp 4 l n/ngày: 8, 14, 22 và 2 giầ ờ; thành phần dinh dưỡng của thức ăn TNT 100 đến TNT 400: protein 40%, chất béo 9,5%, chất xơ 3%, tro 15% và
độ ẩm 10%.
B ng 2.3.ả Chế độ siphon và thay nước trong b ể ương ấ u trùng tôm th chân tr ng ẻ ắ
Giai đoạn T l ỉ ệ nướthay nước siphon và c (%) Giờ/(ngày/lần) Ghi chú
Zoea 3 20 9 - 10 giờ/1 Cấp nước mặn 30‰
Mysis 50 7 giờ/2 Cấp nước mặn 25‰
Postlarvae PLPL1 - 4 50 7 giờ/2 Cấp nước mặn 20‰
5 - 12 50 7 giờ/2 Cấp nước mặn 15‰
Phương pháp thu ấu trùng TTCT:Đối với giai đoạn Z1, Z2, Z3 dùng vợt 54T; giai đoạn M1, M3dùng vợt 21T; giai đoạn PL1, PL4 dùng vợt 15T và giai đoạn PL8, PL12 dùng vợt 12T để thu ấu trùng TTCT; các ký hiệu 12T, 15T, 21T, 54T tương ứng 12 lỗ, 15 lỗ, 21 lỗ, 54 lỗ trong 1 cm2.
* Theo dõi sự tăng trưởng và phát triển của ấu trùng tôm thẻ chân trắng theo Đào Văn Trí (2012) [40]
Xác định tăng trưởng:
- Mỗi lơ thí nghiệm, theo dõi tốc độsinh trưởng dựa vào hai chỉ tiêu chiều dài (L) và khối lượng (W). Sau khi ấu trùng lột xác chuyển giai đoạn, thu mỗi lô 30 mẫu kiểm tra chỉ tiêu chiều dài L (mm), thu 180 mẫu kiểm tra chỉ tiêu về khối lượng W (mg).
- Đo chiều dài L (mm): đo tồn thân tính từ mút chủy đến tận cùng của Telson bằng trắc vi thị kính (với độ chính xác 0,001 mm) đối với giai đoạn Z1 và Z2, bằng thước đo milimet (độ chính xác 0,1 mm) đối với giai đoạn Z3, M1, M3, PL1 và PL4, bằng máy đo tôm đối với giai đoạn PL8 và PL12.
- Cân khối lượng W (mg): thu mỗi nghiệm thức thí nghiệm 180 ấu trùng ở giai đoạn
PL1, PL4, PL8 và PL12. Cân điện tử với độ chính xác 0,001 g đã được sử dụng để cân khối
trùng/mỗi nghiệm thức. Cho 180 ấu trùng tạo thành một lớp mỏng ở giữa miếng lưới thu động vật phù du, rồi đặt lưới chứa ấu trùng tôm lên giấy thấm - thấm cho đến khi giấy thấm khơng cịn ướt. Sau cùng đặt ấu trùng đã được thấm khô trong 1 miếng giấy khô để
cân.
Xác định kích thước ấu trùng:
Giai đoạn zoea được đo qua trắc vi thị kính.
Giai đoạn mysis, postlarvae được đo trên thước kẻ li và máy đo tôm.
Xác định sự phát triển của ấutrùng:
- Theo dõi sự phát triển của ấu trùng tôm thông qua việc theo dõi thời gian chuyển giai
đoạn, với quy ước cứ 50% số cá thể trong lơ thí nghiệm đã chuyển sang giai đoạn kế tiếp.
- Thời gian tính bằng giờ: T(giờ)= T2 - T1
T: là thời gian chuyển giai đoạn của ấu trùng; T2: là thời gian chuyển giai đoạn ở lần
kế tiếp; T1: là thời gian chuyển giai đoạn ở lần trước.
- Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về khối lượng
W = Wt - W0 t - t0
W: tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về khối lượng (g/ngày); Wt: khối lượng (g) tại thời
điểm t; W0: khối lượng (g) tại thời điểm t0 - tvà t 0: số ngày.
- Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về chiều dài
L = L - L0 t - t0
L: tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về chiều dài (mm/ngày); Lt: chiều dài (mm) tại thời
điểm t; L0: chiều dài (mm) tại thời điểm t0 và t - t0: số ngày. Tỉlệ sống của ấu trùng Z, M, Z - PL được tính theo cơng thức:
X % = A + B x 100 C
X: Tỉ lệ sống theo phần trăm; A: Số ấu trùng tôm cịn lại; B: Số ấu trùng tơm lấy để làm thí nghiệm và C: Số ấu trùng tơm ban đầu.
2.3.6.4. Phương pháp thử nghiệm nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng với nguồn con giống được sản xuất bằng Thalassiosira pseudonana nguồn con giống được sản xuất bằng Thalassiosira pseudonana
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên trong 9 ao
gồm 2 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần. Kích cỡ giống tơm thẻ chân trắng PL12
được thả ni trong ao có diện tích 6.400 m2. Mật độ thả ban đầu: 86 con/m2được nuôi tại Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam. Điều kiện thí nghiệm: các ao lót bạt có diện tích và mật độ thả, chế độ sục khí 24/24 giờ, chế độ thức ăn, chế độ chăm sóc và quản lý như nhau. Đối với các ao thuộc lô thử nghiệm sử dụng nguồn giống PL12 được sản xuất từ nguồn thức ăn Thalassiosira pseudonana tươi sống và các ao thuộc lô đối chứng được sử dụng nguồn giống PL12 được sản xuất từ nguồn thức ăn Thalassiosira
weissflogii tươi sống. Nguồn sinh khối T. weissflogii tươi sống để làm thức ăn cho ấu trùng TTCT được nuôi bằng bể composite 3,5 m3trong môi trường AGP 20%, 29 - ‰30 , pH 7,5, 27oC, 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12:12 giờ, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ. MĐTB ban đầu của tảo giống: 0,2 x 106 tb/mL. Thành
phần dinh dưỡng trong sinh khối của T. weissflogii có hàm lượng PUFAs đạt (34,77 ± 0,08)% so với TFA, EPA đạt (13,17 ± 0,14)%; protein đạt (6,63 ± 0,25)% so với SKK, lipít đạt (10,75 ± 1,17)%, carbohydrate (7,86 ± 0,76)%. Sử dụng thức ăn công nghiệp của C.P Việt Nam nhãn hiệu NASA 2200 cho giai đoạn ( - 0,1 1,0 g/con), NASA 2201 (1,0 - 2 g/con),NASA 2202 (2 - 3 g/con) ở dạng mảnh và HI GRO 0803 - S - - (3 5 g/con), LOTUS 4003 - S - (4 6 g/con), HI - PO 7704 - S - (8 15 g/con), C.P 9924(12 - 20 g/con)
ởdạng viên có hàm lượng protein là 38 - 42%.
Chế độ chăm sóc, quản lý: các yếu tố mơi trường được theo dõi hàng ngày hoặc định
kỳ để kịp thời xử lý và khống chế đồng nhất giữa các lơ thí nghiệm. Cho tơm ăn ngày 4 -