2 NH4OH + HSO4 = (NH4)SO4 + HO Chuẩn HSO4dư bằng NaOH:
2.2.2.14Xác định hàm lượng β-glucana theo EBC Nguyên lý
Nguyên lý
Mẫu mạch trước khi sử dụng enzim, phải được rửa bằng dung dịch ethanol 50% để loại bỏ glucose tự do và β - gluco-oligosaccharides có khối lượng phân tử thấp.
Các mẫu mạch sau khi được chuyển về dạng huyền phù và hút nước ở trong dung dịch đệm pH = 6,5 được phản ứng với enzim lichenase tinh khiết. Một phần của dịch lọc sau đó phản ứng hoàn toàn với enzim β - glucosidase tinh khiết. Lượng glucose tạo thành được xác định bằng hóa chất Glucose oxidase/Peroxidase. Dụng cụ - Máy nghiền - Cân phân tích độ chính xác 0,1mg - ống propylen 35 ml - ống nghiệm - Giấy lọc - Máy ly tâm - Máy lắc - Bể điều nhiệt
- Máy so màu bước sóng
510nm
- Pipet 5ml, 10ml, 25ml - Pipet bấm thể tích 100µl ;
200µl
Hóa chất
Dung dịch đệm NaH2PO4: 0,02 mol/lít, pH = 6,5
- Hòa tan 3,12 gam NaH2PO4. 2H2O trong 900 ml H2O
- Điều chỉnh tới pH = 6,5 bằng cách thêm vào khoảng ≈ 50 ml NaOH 0,1 mol/lít. Điều chỉnh V = 1000 ml bằng nước cất và bảo quản ở nhiệt độ 40C
Dung dịch đệm CH3COONa. 3H2O: 0,05mol/lít. pH = 4,0
- Hoà tan 1,2 gam CH3COONa. 3H2O vào 998 ml H2O
- Bổ sung thêm 2,4 ml CH3COOH, kiểm tra lại pH = 4,0 và bảo quản ở
nhiệt độ 40C.
Etanol 50% (V/V)
- Pha loãng toàn bộ lọ chứa nhỏ trong Biocon test (1 ml Lichenase nguyên chất 1000U/ml) với 19 ml NaH2PO4 0,02 mol/l có pH =6,5. Chia thành từng lọ 5ml và bảo quản lạnh đông lạnh giữa các lần sử dụng.
Dung dịch β - glucosidase, 2U/ml.
- Pha loãng toàn bộ lọ chứa nhỏ trong Biocon test (0,5 ml, 80U/ml) thành 20 ml với 0,050 mol/lit đệm axetat natri pH = 4. Chia thành từng lọ 5 ml và bảo quản đông lạnh giữa các lần sử dụng.
Glucose test kit của Megazyme
Dung dịch đệm Natri phosphat: 0,1 mol/lít, pH = 7,4 Glucose oxidastion/peroxidase reagent (GOPOD)
- Dung dịch đệm Glucose bao gồm:
Potassium dihydrogen orthophosphate ( NaH2PO4):136,0 gam Sodium hydroxide (NaOH) : 42,0 gam Para- hydroxybenzoic acid: 30,0 gam Sodium azide: 4,0 gam Ba hóa chất đầu được hoà tan trong 900 ml nước cất bằng cách khuấy ở nhiệt độ phòng. Điều chỉnh pH về7,4 bằng cách sử dụng hoặc HCL 2M hoặc NaOH 2M và sau đó bổ sung sodium azide. Điều chỉnh thể tích về 1 lít. Dung dịch này được bảo quản trong chai tối màu ở 40C và có thể ổn định ít nhất 12 tháng
- Dung dịch đệm Glucose
Pha loãng 50 ml dung dịch đệm đậm đặc thành 1 lít bằng nước cất.
- Dung dịch GOPOD
Hòa tan 1 lọ Megazyme Glucose Determination Reagent vào 1 lít dung dịch đệm phân tích. Dung dịch GOPOD được bảo quản trong bình nâu ở nhiệt độ 40C và thường sử dụng trong vòng 3 tháng.
Dung dịch glucose chuẩn: 1mg/ml ( 100 ml)
Dung dịch chuẩn glucose được chuẩn bị trong axit benzoic 0,2% và có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Ghi chú: Với mỗi lần xác định ít nhất phải có một mẫu mạch đi cùng
Quy trình phân tích
Chuẩn bị mẫu
Xử lý mẫu
• Cho vào ống propylen 35 ml
- Khoảng 1, 0 gam malt đã được nghiền mịn - 5 ml ethanol 50% V
• Lắc đều bằng máy lắc rồi cho thêm 5 ml ethanol 50% V
• Ly tâm trong 10 phút (tốc độ 1000 vòng/ph) sau đó loại bỏ phần nổi phía trên. Cuối cùng thêm 10 ml ethanol 50%, lắc đều rồi đem ly tâm và loại bỏ phần nổi phía trên.
• Thêm 5.0 ml đệm photphat pH 6.5
• Cho vào bồn nước sôi khoảng 5’, sau 2 phút lấy ra nếu mẫu bị đặc thì lắc đều.
Thủy phân băng Lichenaza
• Làm nguội xuống 40oC
• Bổ sung vào mỗi ống 0,2 ml Lichenaza 10U • Đậy nắp, lắc đều
• Giữ 40oC trong thời gian 1 giờ.
• Định mức thành 30 ml bằng nước cất (bổ sung 24 ml nước cất) • Ly tâm 1000 vòng /phút trong 10 phút ở 200C
(Dịch trong thu được là dung dịch A)
Thủy phân bằng β - glucosidase và định lượng glucose tạo thành bằng GOPOD
• Cho vào mỗi ống nghiệm thủy tinh dung tích 12 ml (trong ngoặc là số ống nghiệm cần dùng) Hóa chất Mẫu trắng (1) Mẫu Glucose (1) Mẫu thí nghiệm MĐC (1) MTN (2) 1. Glucose chuẩn (ml) - 0,1 - - 2. Nước cất (ml) 0,1 - - - 3. Dung dịch A (ml) - - 0,1 0,1 4. Đệm Acetat pH 4 (ml) 0,1 0,1 0,1 -
5. β - Glucosidase 0,2U (ml)
-
- - 0,1
* Giữ 400C trong 15 phút ( trừ mẫu trắng và glucose chuẩn)
6. GOPOD ( ml) 3 3 3 3
* Sau khi cho GOPOD giữ tiếp 40 oC/20 phút (Đối với cả mẫu trắng và mẫu glucose chuẩn)
Đo độ hấp phụ ở λ = 510 nm Tính toán kết quả Trong đó: - ∆E = Độ hấp thụ phản ứng - độ hấp thụ mẫu trắng - F=
- 1/1000 : Chuyển từ microgam ra miligam
- 162/180 : Điều chỉnh từ glucose tự do thành glucose ngậm nước (xảyra trong β - glucan)
- 300 : điều chỉnh thể tích ( 0,1 ml 30 ml)
- 100/w : Yếu tố thể hiện hàm lượng β - glucan khi tính theo % chất khô. - W : Khối lượng mẫu phân tích ( khối lượng khô tuyệt đối)
- 10.000 : Yếu tố điều chỉnh thể tích ( 0,1 ml 1000 ml)