Khi lên men dịch đường nồng độ cao, sức sống của nấm men thấp. Sử dụng tỉ lệ tiếp giống thông thường với dịch đường có nồng độ lớn hơn 140Bx thì sức sống của nấm men trong 24h đầu của quá trình lên men gặp phải một số khó khăn. Sức sống và khả năng lên men giảm. Khi nồng độ dịch đường càng tăng, khoảng thời gian bất lợi giai đoạn đầu của quá trình lên men càng kéo dài [21]
Phương pháp nhuộm màu xanh metylen thường được sử dụng để đánh giá tỷ lệ sống chết của tế bào nấm men.Thực tế số tế bào nấm men sống thực sự khi xác định bằng phương pháp màng lọc cao hơn đáng kể so với phương pháp nhuộm xanh metylen đối với dịch đường nồng độ cao hơn mà tỷ lệ tiếp giống thấp hơn [21]. Điều này chỉ ra rằng nhiều tế bào nấm men bắt màu xanh metylen nhưng khi nuôi cấy chúng vẫn phát triển thành khuẩn lạc. Dưới các điều kiện lên men nồng độ cao (áp suất thẩm thấu lớn) ngoài những tế bào chết, các tế bào có sức sống yếu cũng bắt màu xanh metylen, do vậy dùng phương pháp này để xác định tỷ lệ tế bào nấm men sống chết đối với lên men nồng độ cao bao giờ cũng thấp hơn so với số tế bào nấm men sống thực sự [21]. Tuy nhiên, khi tỉ lệ tiếp giống tăng lên so với tỉ lệ tiếp giống thông thường sẽ hạn chế đáng kể sức sống ban đầu của nấm men ngay sau khi tiếp giống. ý nghĩa của việc này đối với lên men nồng độ cao là giảm số lượng tế bào chết trong tỉ lệ tiếp giống thực tế. Mặt khác, khi tỉ lệ tiếp giống càng thấp, hiệu quả sử dụng oxy cho việc tổng hợp lipit càng không có hiệu quả, kết quả là giai đoạn đầu của quá trình lên men bị đình trệ, quá trình lên men kéo dài và nấm men thiếu oxy [21]
Sản xuất bia nồng độ cao có nhiều ưu điểm (như đã nêu ở phần 1), nhưng nó chỉ đạt đựơc khi có những điều kiện sau:
− Thời gian lên men không được vượt quá nhiều ngày so với phương pháp lên men thông thường
− Mức độ lên men phải đạt yêu cầu
− Hương vị của bia phải đựơc duy trì ở mức độ cao − Khối nấm men duy trì sức sống cao
Hiện nay, bia nồng độ cao thường đựơc sản xuất với nồng độ chất khô phổ biến là 14-180Bx. Nếu nồng độ dịch đường cao hơn, hương vị bia sẽ thay đổi do tăng hàm lượng este, đặc biệt là isoamylacetat [21]. Theo kết quả thí nghiệm của Casey và Ingledew ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống và nồng độ dịch đường đến khả năng sống của tế bào nấm men sau 0,5h và 12h được thể hiện qua bảng sau
Bảng 1.10 ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống và nồng độ dịch đường đến khả năng sống của nấm men sau 0,5h và 12h.
Tỷ lệ tiếp giống (Số tế bào /ml) Nồng độ dịch đường (0Bx) Tỷ lệ sống của nấm men sau 0,5h (%) Tỷ lệ sống của nấm men sau 12h (%) 6x106 11,9 93,3 161,7 19,8 81,7 136,7 24,8 76,7 75,0 31,0 58,3 28,2 39,0 45,0 20 14,9 x106 11,5 96,0 147,0 19,1 100 88,6 23,9 87,2 47,0 30,2 69,8 14,8
38,6 50,0 10,1 40 x106 12,1 117,8 151,8 19,8 118,0 149,3 24 112,8 120,8 31,4 111,3 105,0 38,8 63,3 75,8
Ghi chú:Tỷ lệ sống của tế bào nấm men được xác định bằng tỷ số giữa lượng tế bào sống ở thời điểm lấy mẫu và số lượng tế bào ngay sau khi tiếp giống (thời điểm zero)
Những kết quả trên cho thấy việc sử dụng tỷ lệ tiếp giống thông thường trong lên men dịch đường nồng độ cao sẽ dẫn đến hiện tượng một số tế bào bị chết trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Điều này dẫn đến hiệu quả sử dụng và tỷ lệ tiếp giống thực tế sẽ giảm xuống và nấm men có thể giảm hiệu quả sử dụngoxy trong dịch đường cho quá trình tổng hợp lipit. Do đó sẽ hạn chế khả năng tạo sinh khối nấm men, vì vậy mà tốc độ và hiệu suất lên men sẽ giảm. Việc sử dụng tỷ lệ tiếp giống cao hơn tỷ lệ thông thường thì mức độ giảm sức sống của nấm men trong giai đoạn đầu giảm đáng kể, tăng được hiệu quả sử dụng oxy dịch đường của nấm men
ở điều kiện lên men bình thường, tỷ lệ nấm men tiếp giống khoảng (8-12) triệu tế bào/ml. Khi nồng độ dịch đường tăng cần phải tăng tỷ lệ men giống cho phù hợp với việc tăng nồng độ dịch đường [18]. Casey và Ingledew [14] cho rằng lượng tế bào nấm men phù hợp cho lên men là (1,5-2,5)106 tế bào nấm men/1ml dịch đường/1 đơn vị chất khô. Nồng độ dịch đường càng cao, khả năng kết lắng của nấm men càng giảm, nguyên nhân là do mật độ tế bào
nấm men cuối giai đoạn lên men còn lại nhiều. Đối với trường hợp lên men dịch đường nồng độ rất cao cần phải ly tâm để loại nấm men ra khỏi bia [4] Những thí nghiệm lên men dịch đường nồng độc cao đã cho thấy khó khăn chủ yếu trong lên men là sức sống của nấm men trong gia đoạn đầu, quá trình lên men chậm và không triệt để [16]. Trước đây một thời gian dài người ta cho rằng trong quá trình lên men bia, lên men dịch đường được thực hiện bằng những tế bào ở pha ổn định (nongrowing cells), nhưng hiện một số nhà nghiên cứu về bia cho thấy rằng là tốc độ sử dụng đường bởi nấm men trong giai đoạn phát triển logart (growing cells) trong quá trình lên men thực tế cao hơn các tế bào ổn định . Vì vậy, trong sản xuất bia nồng độ cao cả thời gian và mức độ tạo sinh khối nấm men cần phải tăng vượt quá lượng tế bào nấm men lên men dịch đường có nồng độ bình thường để đảm bảo tốc độ lên men. Oxy hòa tan trong dịch đường có vai trò quan trọng đối với sự phát triển của nấm men. Nấm men bia dùng oxy để tổng hợp sterol và axit béo không no [19]. Trong quá trình lên men, sự phát triển của nấm men và tốc độ lên men thường giảm khi hàm lượng lipid đạt tối thiểu. ở tỷ lệ tiếp giống thấp, nấm men sử dụng oxy kém hiệu quả hơn so với tỷ lệ tiếp giống cao [18].Theo Kirsop với dịch đường 150Bx khi tỷ lệ tiếp giống giảm từ 5 gam men sữa/ lít dịch đường xuống 1,5 gam/lít, cả tốc độ và mức độ lên men đều giảm đáng kể do giảm lượng tế bào nấm men trong giai đoạn tạo sinh khối mà nguyên nhân chính là sử dụng oxy để tổng hợp lipid kém hiệu quả.