Phần 5 Kết luận và đề nghị
4.21. Đặc điểm hiện tượng glycosyl hóa ở tiểu phần HA1
Trình tự ở các vị trí glycosyl hóa của 56 chủng virus cúm H5Nx đại diện trong nghiên cứu này khá đa dạng, với 12 kiểu đại diện. Ở mỗi vị trí glycosyl hóa cũng có biến đổi, dẫn tới hiện tượng thêm/ mất khả năng glycosyl hóa. Phần lớn
(34/58) chủng virus có 6 vị trí được glycosyl hóa là 10-NNS, 11-NST, 23-NVT, 165-NNT, 193-NPT và 286-NSS (hình 4.21). Đáng chú ý, hầu hết các chủng thuộc clade 2.3.2.1c có thêm 2 vị trí được glycosyl hóa (so với chủng vacxin clade 1, clade 2.3.4) là 140-NSS và 236-NDT. Vai trò của hiện tượng glycosyl hóa giúp virus lẩn tránh miễn dịch đã được biết ở virus cúm type A (Abe & cs., 2004) và subtype H5 nói riêng (Hervé & cs., 2015). Do vậy, sự thay đổi vị trí/ số lượng điểm được glycosyl hóa ở các chủng virus cúm A/H5Nx phát hiện trong nghiên cứu này có thể dẫn tới khả năng mẫn cảm khác nhau với đáp ứng miễn dịch chống lại virus cúm.
Kết quả phân tích đặc điểm sinh học phân tử tiêu phần protein HA1 của 56 chủng virus cúm A/H5Nx đại diện (hình 4.16 - hình 4.21) cho thấy đại đa số có tính đặc hiệu với receptor của gia cầm và là các chủng virus có độc lực cao. Thêm vào đó, sự biến đổi ở các vùng kháng ngun và vị trí glycosyl hóa đã tạo ra tính đa dạng kháng nguyên giữa các chủng virus trong cùng một clade và giữa các clade.
4.2.2. Đặc tính gây bệnh của virus cúm A/H5 biến chủng mới
Kết quả thí nghiệm xác định chỉ số độc lực của virus được trình bày cụ thể ở phụ lục 11, biểu diễn qua hình 4.22 và hình 4.23.
Hình 4.22. Tỷ lệ gà chết theo thời gian khi gây nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới qua tĩnh mạch
Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả gà đều dương tính với virus cúm A/H5N1 (Ct<35). Những gà chết chậm hơn có xu hướng bài thải nhiều virus hơn
qua đường hầu họng, cụ thể: gà nhóm kiểm tra độc lực virus clade 2.3.2.1c có 7/10 gà chết trong ngày đầu sau gây nhiễm, và toàn bộ gà chết trong ngày thứ 2, điểm lâm sàng trung bình của nhóm là 2,95; gà nhóm kiểm tra độc lực virus clade 2.3.4.4a ngày đầu có 3/10 gà chết, ngày thứ 2 thêm 4 con chết, và toàn bộ gà chết trong ngày thứ 3 sau gây nhiễm virus, điểm lâm sàng trung bình của nhóm là 2,78; gà nhóm kiểm tra độc lực virus clade 2.3.4.4b ngày đầu có 6/10 gà chết, ngày thứ 2 thêm 3 con chết, và toàn bộ gà chết trong ngày thứ 3 sau gây nhiễm virus, điểm lâm sàng trung bình của nhóm là 2,87 (hình 4.23A) (phụ lục 11).
Virus H5N1 clade 2.3.2.1c và H5N6 clade 2.3.4.4b bắt đầu gây chết gà sau 12h gây nhiễm. Sau 24h đầu tiên, hai chủng virus này đã gây chết lần lượt cho 70% và 60% gà thí nghiệm. Trong khi đó virus H5N6 clade 2.3.4.4a bắt đầu gây chết gà muộn hơn (sau 24h) và chỉ có 30% gà chết. Virus H5N1 clade 2.3.2.1c gây chết 100% gà thí nghiệm trong thời gian 48h sau khi gây nhiễm. Hai chủng virus H5N6 clade 2.3.4.4a & b cần thời gian lâu hơn (60h) để gây chết 100% động vật thí nghiệm (hình 4.22).
Từ kết quả trên có thể nhận định, virus clade 2.3.2.1c gây chết nhanh gà thí nghiệm với tỷ lệ cao, tiếp đến là virus clade 2.3.4.4b và clade 2.3.4.4a.
Kết quả thể hiện trên hình 4.22 cho thấy: hầu hết gà thí nghiệm chết đột ngột trong vòng 24h đầu tiên sau gây nhiễm; chỉ số IVPI đều cho thấy cả 3 biến chủng đều có độc lực cao theo tiêu chuẩn đánh giá của OIE. Với kết quả chỉ số IVPI của các biến chủng H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N6 clade 2.3.4.4b tương ứng là 2.95; 2,78 và 2,87 (phụ lục 11) phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Đăng Thọ & cs. (2016). Để so sánh độc lực của các biến chủng, chúng tôi đã tiến hành phân tích về số gà chết sau gây nhiễm với thời gian chết trung bình ở các lơ gà thí nghiệm, kết quả được biểu diễn ở hình 4.23.
Thời gian trung bình gây chết gà thí nghiệm khi sử dụng virus H5N1 clade 2.3.2.1c (27.6h) là nhanh nhất, tiếp đến là virus H5N6 clade 2.3.4.4b (31.2h) và cuối cùng là virus H5N6 clade 2.3.4.4a (43.2h) (hình 4.23B).
Qua kết quả trên, ta thấy có sự liên hệ giữa độc lực của virus với thời gian gây chết gà thí nghiệm. Những virus có độc lực cao hơn thì thời gian gây chết gà thí nghiệm nhanh hơn, tỷ lệ chết cũng lớn hơn.
A B
Hình 4.23. Chỉ số độc lực của virus và thời gian chết trung bình của gà khi gây nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới
4.2.3. Triệu chứng bệnh tích do virus cúm A/H5 biến chủng mới gây ra trên gia cầm gia cầm
4.2.3.1. Triệu chứng lâm sàng của gà gây nhiểm virus cúm A/H5 biến chủng mới
Sau khi công cường độc, kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng đánh giá theo thang điểm của OIE của gà được gây nhiễm virus CGC H5N1 clade 2.3.2.1c, virus CGC H5N6 clade 2.3.4.4 a, clade 2.3.4.4 b được tổng hợp chi tiết ở phụ lục 12 và biểu diễn ở hình 4.24.
Qua theo dõi thí nghiệm cho thấy:
Gà đối chứng đều khỏe mạnh, tăng trọng tốt và khơng có bất cứ biểu hiện bất thường nào. Trong khi tất cả gà gây bệnh thực nghiệm với virus CGC chết với tỷ lệ 100% vào ngày thứ 5, cụ thể:
Gà gây nhiễm virus H5N1 clade 2.3.2.1c có điểm lâm sàng trung bình cao nhất là 2.72, một nửa số gà gây nhiễm virus có biểu hiện triệu chứng bệnh vào ngày đầu tiên sau CCĐ với triệu chứng: sốt cao, ủ rũ, mệt mỏi, chảy nước mắt, nước mũi, thở khị khè, vảy mỏ. Có 2/10 gà chết đột ngột không quan sát thấy triệu chứng lâm sàng. 70% (7/10 con) số gà chết vào ngày thứ 2 và 30% (3/10 con) còn lại chết vào ngày thứ 3. Như vậy, gà có biểu hiện triệu chứng rất sớm và chết nhanh, tỷ lệ chết 100% sau 3 ngày CCĐ.
Gà gây nhiễm virus CGC H5N6 clade 2.3.4.4 a có điểm lâm sàng trung bình thấp nhất là 2.29, diễn biến về biểu hiện lâm sàng chậm. Gà bắt đầu có biểu hiện triệu chứng vào ngày thứ 2 sau gây bệnh với tỷ lệ 30% (3/10 con), 70% gà đến ngày thứ 3 mới biểu hiện triệu chứng. Các triệu chứng gồm: ủ rũ, mệt mỏi, nước mắt, nước mũi chảy, thở khò khè, vảy mỏ, gà phải rướn cao mỏ để thở, mắt bị viêm, mặt phù nề, mào tích tím tái dày lên do thủy thũng, dưới da vùng chân có xuất huyết. Ngồi ra, gia cầm cịn có biểu hiện thần kinh như run rẩy, đi khơng vững, ủ rũ, nằm li bì tụ đống với nhau, một số bãi phân và lẫn máu. Gà chết nhiều nhất vào ngày thứ 4 với tỷ lệ 60% (6/10 con) và đạt đến 100% vào ngày thứ 5.
Gà gây nhiễm virus CGC H5N6 clade 2.3.4.4b có điểm lâm sàng trung bình là 2.50, các biểu hiện lâm sàng biểu hiện tương tự nhưng xảy ra chậm hơn so với gà gây nhiễm virus H5N1 clade 2.3.2.1c và nhanh hơn so với gà gây nhiễm virus H5N1 clade 2.3.4.4a.
Qua kết quả trên cho thấy các virus H5N1 2.3.2.1c, H5N6 2.3.4.4a, 2.3.4.4b gây triệu chứng trên gà khá tương đồng với các chủng virus H5N6 ở các nước khác như Trung Quốc, Lào với các triệu chứng chủ yếu là: ủ rũ, lông dựng, sưng mặt, sung huyết, xuất huyết mào tích và chân, xuất huyết dưới da, phù xung quanh cẳng chân, khuỷu chân và triệu chứng thần kinh (Sun & cs., 2016; Xiang & cs., 2017; Butler & cs., 2016). Nhiều triệu chứng do virus H5N6 cũng xảy ra tương tự như do virus H5N6 clade 2.3.2.1 gây ra như phù mí mắt, ít vận động, giảm ăn, khát nước, lơng dựng, tím mào, ngoẹo cổ và các triệu chứng thần kinh
(Jiao & cs., 2016). Tuy nhiên ngoài các triệu chứng trên, các triệu chứng viêm mắt, sưng phù mặt là các triệu chứng khá phổ biến ở gà nhiễm virus H5N6 của Việt Nam. Điều đáng chú ý là với các virus H5N1 2.3.2.1c thường có triệu chứng hơ hấp nặng như chảy nhiều nước mắt, nước mũi, hen khẹc, vảy mỏ... thì các virus H5N6 ít có hiện tượng này. Sự khác biệt về kiểu gây bệnh này cũng có thể giải thích cho hiện tượng gà nhiễm virus H5N1 2.3.2.1c chết nhanh hơn gà nhiễm virus H5N6 do các dịch tiết ở đường hô hấp quá nhiều làm tắc đường thở và gây chết đột ngột gà. Hiện tượng này cũng được thấy ở trong các nghiên cứu gây bệnh trên gà trước đây với các virus H5N1 (Suzuki & cs., 2009). Từ kết quả trên cho thấy, điểm trung bình về triệu chứng giữa 3 nhóm gà thí nghiệm có sự khác nhau nhưng các triệu chứng tương tự nhau. Những triệu chứng lâm sàng quan sát được trong thí nghiệm đều phù hợp với đặc điểm của gà bị nhiễm CGC độc lực cao đã được nêu ra (OIE, 2015; Nguyễn Bá Hiên, 2014). Như vậy trong chẩn đoán bệnh CGC ở gà, những biểu hiện bệnh như gà xù lơng, ít vận động, mào tích tím tái, ngoẹo cổ, xuất huyết dưới da, chết ồ ạt, cho phép suy đoán nguyên nhân của bệnh là do nhiễm virus CGC.
4.2.3.2. Bệnh tích đại thể của gà được gây bệnh thực nghiệm với virus cúm A/H5 biến chủng mới
Sau khi kết thúc thí nghiệm công cường độc, tiến hành mổ khám gà thí nghiệm để kiểm tra bệnh tích đại thể:
Gà nhóm thí nghiệm clade 2.3.2.1c có bệnh tích chủ yếu xuất hiện ở đường hơ hấp (hình 4.25): niêm mạc xoang mũi, miệng bị sung huyết, chảy dịch (hình 4.25A); khí quản xuất huyết nặng (hình 4.25B); phổi phù, sung huyết, xuất huyết (hình 4.25C). Ngồi ra, cịn một số gà quan sát thấy: tuyến tụy xuất huyết (hình 4.25D); trực tràng xuất huyết (hình 4.25E); phù,xuất huyết dưới da vùng đầu (hình 4.25F); não sung huyết (hình 4.25G); xuất huyết mỡ vành tim (hình 4.25H). Tuy nhiên, một số con khơng biểu hiện bệnh tích rõ ràng có thể do chết q cấp tính nên khơng quan sát thấy tổn thương về đại thể.
Gà nhóm thí nghiệm clade 2.3.4.4a, bệnh tích cũng tập trung ở đường hô hấp tương tự như nhóm clade 2.3.2.1c nhưng diễn biến chậm hơn, số lượng gà có biểu hiện bệnh tích nhiều hơn, cụ thể (hình 4.25): da chân xuất huyết (hình 4.25I); khí quản thấy chứa nhiều dịch, xuất huyết (hình 4.25J); phổi phù, sung
huyết và xuất huyết (hình 4.25K); kiểm tra niêm mạc ruột, 7/10 con có các đám xuất huyết (hình 4.25L); 8/10 con có xuất huyết ở hậu mơn (hình 4.25M); 4/10 con phù, xuất huyết dưới da vùng đầu (hình 4.25N); 5/10 con não xuất huyết (hình 4.25O); 6/10 con có mỡ vành tim xuất huyết (hình 4.25P).
Gà nhóm thí nghiệm clade 2.3.4.4b, bệnh tích cũng tập trung ở đường hơ hấp tương tự như 2 nhóm trên, với các bệnh tích cụ thể như: mào tích tím tái, xuất huyết (hình 4.25Q); khí quản xuất huyết (hình 4.25R); phổi phù và xuất huyết (hình 4.25S); tuyến tụy xuất huyết (hình 4.25T); túi Fabricius phù Tuyến (hình 4.25U); lách phù, xuất huyết (hình 4.25V); não xuất huyết (hình 4.25W); xuất huyết mỡ vành tim (hình 4.25X).
Như vậy, qua kết quả thí nghiệm cho thấy bệnh tích chủ yếu của gà được gây bệnh thực nghiệm với virus cúm H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b xuất hiện ở nhiều cơ quan trong cơ thể với đặc trưng là phù, sung huyết và xuất huyết.
Trong đó, bệnh tích trầm trọng nhất tập trung ở đường hơ hấp, gồm xoang mũi, xoang miệng, khí quản và phổi. Khí quản thấy chứa nhiều dịch, xuất huyết; phổi phù, sung huyết và xuất huyết rất nặng. Điều này giải thích cho các triệu chứng quan sát được khi theo dõi lâm sàng như: khó thở, chảy nước mũi, vẩy mỏ. So sánh với gà được gây bệnh thực nghiệm với virus CGC H5N1 (Pfeiffer & cs., 2009), bệnh tích đại thể ở phổi giống nhau, trong khi bệnh tích ở xoang mũi và miệng không được đề cấp đến. So với kết quả khảo sát của Lê Văn Năm (2004), về bệnh tích đại thể bệnh CGC ở một số cơ sở chăn ni các tỉnh phía Bắc từ phổi viêm cata, xuất huyết đến viêm thể fibrin. Trên gà tây gây bệnh thực nghiệm với virus CGC FAV002/H5N1, cũng có bệnh tích chủ yếu là viêm màng phổi dạng fibrin trong khi ở ngan còn thấy phù phổi và sung huyết ở khí quản (Berhane & cs., 2016).
Tần số xuất hiện bệnh tích ở đường tiêu hóa cũng chiếm tỷ lệ cao với đặc điểm thành ruột dầy, có các đám xuất huyết ở vùng niêm mạc và mảng Peyer vùng ruột non. Lớp niêm mạc manh tràng, vùng hậu môn, điểm nối hồi manh tràng cũng có biểu hiện sung huyết, xuất huyết.
Clade 2.3.2.1c Clade 2.3.4.4a Clade 2.3.4.4b
Ghi chú: (A) xoang mũi, miệng, chảy dịch; (B; R) khí quản xuất huyết; (C; K; S) phổi phù, xuất huyết; (D; T) tuyến tụy xuất huyết; (E) trực tràng xuất huyết; (F;N) da vùng đầu phù, xuất huyết; (G) não sung huyết; (H; P; X) mỡ vành tim xuất huyết; (I) da chân xuất huyết; (J) khí quản chứa dịch, xuất huyết; (L) ruột xuất huyết; (M) hậu môn xuất huyết; (O; W) não xuất huyết;(Q) mào tích xuất huyết; (U) túi Fabricius phù; (V) lách phù, xuất
huyết; Mũi tên chỉ các điểm xuất huyết ở tổ chức.
Hình 4.25. Bệnh tích đại thể của gà được gây bệnh thực nghiệm với virus cúm A/H5 biến chủng mới
A B C D E F G H I Q R J K S L T M U V O N X P W
Điều này phù hợp với các triệu chứng ỉa chảy, phân lẫn máu đã quan sát được khi theo dõi lâm sàng. Những bệnh tích này giống với gà bị nhiễm virus CGC ở ngoài thực địa như với các đặc điểm viêm xuất huyết đường ruột, đặc biệt vùng lỗ huyệt, điểm nối hồi manh tràng, dạ dày tuyến và niêm mạc tá tràng (Lê Văn Năm, 2004). Đối với gà gây bệnh thực nghiệm với virus cúm H5N1, bệnh tích chỉ được miêu tả xuất huyết mảng Peyer và điểm nối hồi manh tràng (Pfeiffer & cs., 2009).
Giải thích cho những bệnh tích xuất hiện nhiều ở đường hơ hấp và ruột là quá trình xâm nhập và nhân lên của virus CGC ở các cơ quan này đầu tiên khi chúng hít phải virus. Trypsin giống những enzyme ở tế bào biểu mô của đường hô hấp và tiêu hóa cho phép phân tách hemagglutinin bề mặt, virus xâm nhập, nhân lên, giải phóng các virion trong đường hô hấp và đường tiêu hóa. Sau đó các virion này xâm nhập vào lớp hạ niêm mạc rồi đi vào mao mạch. Virus nhân lên trong tế bào nội mạc, phát tán ra toàn bộ cơ thể thơng qua hệ tuần hồn và bạch huyết dẫn tới gây nhiễm, nhân lên ở nhiều loại tế bào trong các cơ quan nội tạng, não và da (Swayne & Halvorson, 2008).
Qua mổ khám thấy những tổn thương đại thể quan sát được đã lý giải các triệu chứng lâm sàng của gà theo dõi được sau khi gây bệnh. Bệnh tích đại thể biểu hiện ở gà cũng phản ánh sự tấn công của virus CGC H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b đã gây ra các biểu hiện có tính tồn thân. Do đó khi mắc bệnh CGC H5N1, H5N6 biểu hiện bệnh lý thường nặng nề dẫn đến tỷ lệ chết cao.
Kết quả quan sát thấy gà chết ở thể cấp tính khơng có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích trong nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu trước đây, triệu chứng và bệnh tích bắt đầu xuất hiện từ 48h và rõ rệt lúc 72h sau gây nhiễm với những gà sống sót qua giai đoạn á cấp tính (Suzuki & cs., 2009; Wibawa & cs., 2013). Đối với gà có bệnh tích thì những bệnh tích của gà nhiễm H5N6 clade 2.3.4.4a và clade 2.3.4.4b rất khó phân biệt với nhau và rất khó phân biệt với bệnh tích của gà nhiễm virus H5N1 clade 2.3.2.1c. Tuy nhiên các bệnh tích thu thập được trong nghiên cứu này là khá đầy đủ so với những nghiên cứu trước đây khi chỉ có một số bệnh tích được mơ tả như lách sưng to, lốm đốm, viêm phổi đặc, phù, sung huyết và xuất huyết, xuất huyết ở mảng Payer, hạch ruột tịt, xuất huyết điểm màng tim như ở gà nhiễm virus H5N1 clade 2.3.4 (Pfeiffer & cs., 2009), tổn thương hoại tử, xuất huyết ở các cơ quan nội tạng như màng thanh dịch, niêm mạc, lách và gan ở gà nhiễm virus H5N8 clade 2.3.4.4 (Bae & cs., 2015), xuất huyết đinh ghim nhẹ ở mỡ dưới da, sung huyết, xuất
huyết và hoại tử ở phổi, gan to màu hổ phách (Jiao & cs., 2016). Hơn nữa, nhiều nghiên cứu gần đây với virus H5N6 cũng không mô tả các biến đổi bệnh lý khi thực hiện thí nghiệm gây bệnh trên gà (Xiang & cs., 2017).
Đồng thời kết quả cũng phản ánh những biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc CGC H5N6 tương đối giống với những biến đổi bệnh lý của gà mắc cúm H5N1.
4.2.3.3. Bệnh tích vi thể của gà được gây bệnh thực nghiệm với virus cúm A/H5 biến chủng mới
Gà sau khi mổ khám, lấy 15 mẫu ngẫu nhiên làm tiêu bản để kiểm tra bệnh