Sau khi hoàn thành lấy mẫu xét nghiệm trên 6649 gà, 12991 ngan/vịt và 10900 chim cút. Mẫu được thu thập và sàng lọc virus cúm A. Kết quả xét nghiệm được thể hiện ở phụ lục 5, biểu diễn qua hình 4.1 và hình 4.2.
Hình 4.1. Kết quả sàng lọc virus cúm A tại các tỉnh giám sát
Virus cúm A được phát hiện ở tất cả 11 tỉnh nghiên cứu, tỷ lệ nhiễm virus cúm A tại Nghệ An cao nhất (34,67%), tiếp đến là Kiên Giang (32,67%), Kon Tum 27,17%, Vĩnh Long với 10,68%, Quảng Ngãi với 9,11%, Đồng Tháp 8,15%, Hà Nội 7,26%, Quảng Nam 7,23%, Thừa Thiên Huế 4,64%, Phú Thọ 4,55% và thấp nhất là Thái Nguyên với 1,34% (hình 4.1).
Trong tổng số 30540 mẫu thu được tại 11 tỉnh có 2794 mẫu dương tính với virus cúm A, chiếm tỷ lệ 9,15% (hình 4.2A). Kết quả này thấp hơn so với kết quả giám sát tại 14 tỉnh của Cục Thú y các năm từ 2011 đến 2013 với tỷ lệ gia cầm dương tính với virus cúm A là 22,1% (tổng số 2162/9790 mẫu dương tính) (Nguyen & cs., 2014).
So sánh tỷ lệ phát hiện virus cúm A theo miền, chúng tôi thấy: tỷ lệ nhiễm virus cúm A ở miền Trung là cao nhất với 1670 mẫu dương tính trong 13590
mẫu xét nghiệm, chiếm tỷ lệ 12,29%. Tiếp theo là miền Nam với 682/6870 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ 9,93%. Thấp nhất là 3 tỉnh miền Bắc với tỷ lệ trung bình là 4,38% (hình 4.2A).
A B
Hình 4.2. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A theo giai đoạn và khu vực giám sát
Trong thời gian nghiên cứu, mẫu được lấy thành 3 giai đoạn: giai đoạn 1 từ tháng 1/2015 đến tháng 6/2016, giai đoạn 2 từ tháng 7/2016 đến 6/2017 và giai đoạn 3 từ tháng 7/2017 đến tháng 3/2018. So sánh kết quả xét nghiệm theo giai đoạn chúng tôi thấy rằng: tỷ lệ nhiễm virus cúm A trong giai đoạn 1 là cao nhất với 12,78% (786 mẫu dương tính virus cúm A trong 6148 mẫu kiểm tra), tiếp theo là ở giai đoạn 3 với tỷ lệ nhiễm virus cúm A là 9,94%. Thấp nhất là tỷ lệ nhiễm virus cúm A trong giai đoạn 2 với 7,16% (hình 4.2B).
Kết quả xét nghiệm cũng cho thấy, gia cầm khỏe mạnh tại các chợ buôn bán gia cầm sống mặc dù không có biểu hiện lâm sàng của bệnh CGC nhưng vẫn mang virus này ở đường hô hấp (9,15%). Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng vịt là vật mang virus CGC. Thủy cầm và đặc biệt là vịt, mặc dù mang mầm mà không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng nhưng thường xuyên bài thải mầm bệnh ra môi trường tạo nguồn lây nhiễm cho các động vật cảm thụ khác. Thủy cầm, bao gồm cả vịt, là những bể chứa tự nhiên của virus CGC type A và đóng vai trò là vật chủ lan truyền virus. Từ thủy cầm,
Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra liên hệ giữa trình tự amino acid ở gần vị trí cắt và độc lực của virus cúm (Senne & cs., 1996). Đối với virus cúm thể độc lực cao, ở tiểu phần HA1 và gần vị trí cắt tồn tại nhiều amino acid kiềm tính. Đối chiếu với motif B-X-B-R điển hình của các chủng virus cúm A có độc lực cao (với B là amino acid kiềm tính, X là amino acid không có tính kiềm và R là arginine) (Senne & cs., 1996). Trong 84 chủng được giải trình tự (đã dùng để xây dựng cây phả hệ), có 6 chủng [16H5-VL3-241, 16H5-VL3-254, 16H5-VL3-422, 16H5-VL3-535 (clade 2.3.2.1c) và 16H5-QNG3-153, 16H5-QNG3-301 (clade 2.3.4.4b)] bị khuyết thiếu nucleotit ở vị trí cắt giữa tiểu phần HA1 và HA2. Do đó, chỉ có 78 trình tự gen HA1 được dùng để phân tích đặc điểm biến đổi trình tự ở cấp độ nucleotit và amino acid. Có thể thấy, 77/78 chủng virus thuộc clade 2.3.2.1c và 2.3.4.4a/b mang đặc trưng này (hình 4.17). Motif cơ bản của các chủng virus cúm trong nghiên cứu này là PQRERRRKR|GLF (2.3.2.1c), PLREKRRKR|GLF (2.3.4.4a/b). Dựa vào trình tự amino acid ở gần vị trí cắt HA1-HA2 cho phép suy đoán các biến chủng virus cúm kể trên là thể độc lực cao.
4.2.1.2. Đặc điểm trình tự amino acid ở hốc gắn thụ thể
Dựa vào nghiên cứu đã công bố của Sun & cs.(2013), trình tự 3 vùng cấu thành nên hốc gắn thụ thể của tế bào vật chủ đã được xác định (hình 4.17).
Trong 78 trình tự gen HA1 lựa chọn phân tích đặc điểm trình tự amino acid ở hốc gắn thụ thể, tiếp tục cắt bỏ những trình tự giống nhau (dùng công cụ Duplicate finder) còn lại 56 trình tự gen HA1.
Ghi chú: trong 56 trình tự HA1 của virus cúm H5Nx, chỉ giữ lại các trình tự đại diện, với tần suất xuất hiện được thể hiện trong dấu [] ở trước tên chủng virus. Vị trí amino acid đặc hiệu cho thụ thể của gia
cầm được đóng khung. Mũi tên chỉ các amino acid thay đổi khác biệt.
Trong 56 trình tự HA1 lựa chọn nghiên cứu, chỉ giữ lại các trình tự đại diện (13 trình tự), với tần suất xuất hiện (số virus cùng đặc điểm trình tự amino acid ở hốc gắn thụ thể tế bào vật chủ) được thể hiện ở trước tên chủng virus. Về đột biến ở hốc gắn với thụ thể của vật chủ, 18/18 chủng thuộc clade 2.3.2.1c, 9/9 chủng thuộc clade 2.3.4.4a và 25/29 chủng thuộc clade 2.3.4.4b mang trình tự amino acid Q-222 và G-224 có ái lực cao, đặc hiệu với receptor ở gia cầm (Ha & cs., 2001; Bui & cs., 2014; Tzarum & cs., 2015). Tuy nhiên, có 4/29 chủng virus thuộc clade 2.3.4.4b mang đột biến G-224-E (hình 4.18). Đặc biệt, trong 4 chủng kể trên có 1 chủng (16H5-KT2-242) đột biến ở cả 2 vùng đặc hiệu với thụ thể của gia cầm là E-186-K và G-224-E (mũi tên hình 4.18). Ảnh hưởng của các đột biến này chưa được làm rõ trong phạm vi nghiên cứu.
4.2.1.3. Đặc điểm trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E
Tiểu phần HA1 của protein HA cấu tạo thành phần nhô lên trên bề mặt hạt virus và bộc lộ vị trí kháng nguyên với hệ miễn dịch, do đó có tốc độ thay đột biến cao (Kirkpatrick & cs., 2018). Trình tự amino acid ở 5 vùng kháng nguyên nằm trên tiểu phần HA1 tiếp tục được phân tích để làm rõ đặc điểm đột biến giữa các virus trong cùng clade hoặc giữa các clade (hình 4.18 - hình 4.20).
Ghi chú: 5 vùng kháng nguyên được ký hiệu bằng màu đỏ (A), xanh lá cây (B), đen (C), vàng (D) và tím (E). “X” và “.” lần lượt biểu thị vị trí chưa xác định chính xác amino acid và vị trí có amino acid giống
với trình tự ở trên cùng.
Ghi chú: 5 vùng kháng nguyên được ký hiệu bằng màu đỏ (A), xanh lá cây (B), đen (C), vàng (D) và tím (E). “X” và “.” lần lượt biểu thị vị trí chưa xác định chính xác amino acid và vị trí có amino acid giống
với trình tự ở trên cùng.
Ghi chú: 5 vùng kháng nguyên được ký hiệu bằng màu đỏ (A), xanh lá cây (B), đen (C), vàng (D) và tím (E). “X” và “.” lần lượt biểu thị vị trí chưa xác định chính xác amino acid và vị trí có amino acid giống
với trình tự ở trên cùng.
Hình 4.20. Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.3.4.4a
Về đột biến ở các vùng kháng nguyên (A- E), so với 2 chủng virus vacxin được dùng trong nghiên cứu này (clade 1, clade 2.3.4), hầu hết các chủng virus thuộc 3 clade 2.3.2.1c và 2.3.4.4a/b đều có thay đổi amino acid tại 5 vùng kháng nguyên. Trong 5 vùng đó, vùng kháng nguyên A và D có nhiều đột biến nhất, đặc biệt là ở các vị trí amino acid 123, 127, 134- 137 (vùng kháng nguyên A) và 192, 198-199 (vùng kháng nguyên D). Sự thay đổi amino acid ở các vùng kháng nguyên là tương đối phổ biến đối với virus cúm nói chung và subtype H5Nx nói riêng (Liu & cs., 2016). Ngược lại, có một số vị trí trong mỗi vùng kháng nguyên ít/ không có thay đổi, ví dụ như vị trí 112 (vùng kháng nguyên A); 177, 179-180 (vùng kháng nguyên B); 43-44 (vùng kháng nguyên C); 165, 196, 208, 211 (vùng kháng nguyên D); 63, 83 (vùng kháng nguyên E). Kết quả trình bày ở hình 4.19- hình 4.21 còn cho biết đột biến điểm ở tiểu phần HA1 còn xuất hiện ở các vị trí kề bên những vùng kháng nguyên. Đặc điểm này cũng đã được mô tả trong nhiều
nghiên cứu về virus cúm gia cầm (Bui & cs., 2014; Nguyen & cs., 2017; Ohkawara & cs., 2017).
4.2.1.4. Đặc điểm glycosyl hóa ở tiểu phần HA1
Kết quả dự đoán khả năng gắn kết một gốc đường (oligosaccharide) vào amino acid asparagin (N) ở tiểu phần HA1 được trình bày ở hình 4.22.
Ghi chú: Phần mềm NetNGlyc 1.0 dự đoán có 10 vị trí có hiện tượng glycosyl hóa (số thứ tự ở trên trình tự). Dấu “.” biểu thị amino acid giống với trình tự ở trên cùng. Dấu “-“ biểu thị không có amino acid ở vị trí tương ứng. Trong 56 trình tự HA1 của virus cúm H5Nx, chỉ giữ lại các trình tự đại diện, với tần suất
xuất hiện được thể hiện trong dấu [] ở trước tên chủng virus.
Hình 4.21. Đặc điểm hiện tượng glycosyl hóa ở tiểu phần HA1
Trình tự ở các vị trí glycosyl hóa của 56 chủng virus cúm H5Nx đại diện trong nghiên cứu này khá đa dạng, với 12 kiểu đại diện. Ở mỗi vị trí glycosyl hóa cũng có biến đổi, dẫn tới hiện tượng thêm/ mất khả năng glycosyl hóa. Phần lớn
(34/58) chủng virus có 6 vị trí được glycosyl hóa là 10-NNS, 11-NST, 23-NVT, 165-NNT, 193-NPT và 286-NSS (hình 4.21). Đáng chú ý, hầu hết các chủng thuộc clade 2.3.2.1c có thêm 2 vị trí được glycosyl hóa (so với chủng vacxin clade 1, clade 2.3.4) là 140-NSS và 236-NDT. Vai trò của hiện tượng glycosyl hóa giúp virus lẩn tránh miễn dịch đã được biết ở virus cúm type A (Abe & cs., 2004) và subtype H5 nói riêng (Hervé & cs., 2015). Do vậy, sự thay đổi vị trí/ số lượng điểm được glycosyl hóa ở các chủng virus cúm A/H5Nx phát hiện trong nghiên cứu này có thể dẫn tới khả năng mẫn cảm khác nhau với đáp ứng miễn dịch chống lại virus cúm.
Kết quả phân tích đặc điểm sinh học phân tử tiêu phần protein HA1 của 56 chủng virus cúm A/H5Nx đại diện (hình 4.16 - hình 4.21) cho thấy đại đa số có tính đặc hiệu với receptor của gia cầm và là các chủng virus có độc lực cao. Thêm vào đó, sự biến đổi ở các vùng kháng nguyên và vị trí glycosyl hóa đã tạo ra tính đa dạng kháng nguyên giữa các chủng virus trong cùng một clade và giữa các clade.
4.2.2. Đặc tính gây bệnh của virus cúm A/H5 biến chủng mới
Kết quả thí nghiệm xác định chỉ số độc lực của virus được trình bày cụ thể ở phụ lục 11, biểu diễn qua hình 4.22 và hình 4.23.
Hình 4.22. Tỷ lệ gà chết theo thời gian khi gây nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới qua tĩnh mạch
Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả gà đều dương tính với virus cúm A/H5N1 (Ct<35). Những gà chết chậm hơn có xu hướng bài thải nhiều virus hơn
qua đường hầu họng, cụ thể: gà nhóm kiểm tra độc lực virus clade 2.3.2.1c có 7/10 gà chết trong ngày đầu sau gây nhiễm, và toàn bộ gà chết trong ngày thứ 2, điểm lâm sàng trung bình của nhóm là 2,95; gà nhóm kiểm tra độc lực virus clade 2.3.4.4a ngày đầu có 3/10 gà chết, ngày thứ 2 thêm 4 con chết, và toàn bộ gà chết trong ngày thứ 3 sau gây nhiễm virus, điểm lâm sàng trung bình của nhóm là 2,78; gà nhóm kiểm tra độc lực virus clade 2.3.4.4b ngày đầu có 6/10 gà chết, ngày thứ 2 thêm 3 con chết, và toàn bộ gà chết trong ngày thứ 3 sau gây nhiễm virus, điểm lâm sàng trung bình của nhóm là 2,87 (hình 4.23A) (phụ lục 11).
Virus H5N1 clade 2.3.2.1c và H5N6 clade 2.3.4.4b bắt đầu gây chết gà sau 12h gây nhiễm. Sau 24h đầu tiên, hai chủng virus này đã gây chết lần lượt cho 70% và 60% gà thí nghiệm. Trong khi đó virus H5N6 clade 2.3.4.4a bắt đầu gây chết gà muộn hơn (sau 24h) và chỉ có 30% gà chết. Virus H5N1 clade 2.3.2.1c gây chết 100% gà thí nghiệm trong thời gian 48h sau khi gây nhiễm. Hai chủng virus H5N6 clade 2.3.4.4a & b cần thời gian lâu hơn (60h) để gây chết 100% động vật thí nghiệm (hình 4.22).
Từ kết quả trên có thể nhận định, virus clade 2.3.2.1c gây chết nhanh gà thí nghiệm với tỷ lệ cao, tiếp đến là virus clade 2.3.4.4b và clade 2.3.4.4a.
Kết quả thể hiện trên hình 4.22 cho thấy: hầu hết gà thí nghiệm chết đột ngột trong vòng 24h đầu tiên sau gây nhiễm; chỉ số IVPI đều cho thấy cả 3 biến chủng đều có độc lực cao theo tiêu chuẩn đánh giá của OIE. Với kết quả chỉ số IVPI của các biến chủng H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N6 clade 2.3.4.4b tương ứng là 2.95; 2,78 và 2,87 (phụ lục 11) phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Đăng Thọ & cs. (2016). Để so sánh độc lực của các biến chủng, chúng tôi đã tiến hành phân tích về số gà chết sau gây nhiễm với thời gian chết trung bình ở các lô gà thí nghiệm, kết quả được biểu diễn ở hình 4.23.
Thời gian trung bình gây chết gà thí nghiệm khi sử dụng virus H5N1 clade 2.3.2.1c (27.6h) là nhanh nhất, tiếp đến là virus H5N6 clade 2.3.4.4b (31.2h) và cuối cùng là virus H5N6 clade 2.3.4.4a (43.2h)(hình 4.23B).
Qua kết quả trên, ta thấy có sự liên hệ giữa độc lực của virus với thời gian gây chết gà thí nghiệm. Những virus có độc lực cao hơn thì thời gian gây chết gà thí nghiệm nhanh hơn, tỷ lệ chết cũng lớn hơn.
A B
Hình 4.23. Chỉ số độc lực của virus và thời gian chết trung bình của gà khi gây nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới
4.2.3. Triệu chứng bệnh tích do virus cúm A/H5 biến chủng mới gây ra trên gia cầm gia cầm
4.2.3.1. Triệu chứng lâm sàng của gà gây nhiểm virus cúm A/H5 biến chủng mới
Sau khi công cường độc, kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng đánh giá theo thang điểm của OIE của gà được gây nhiễm virus CGC H5N1 clade 2.3.2.1c, virus CGC H5N6 clade 2.3.4.4 a, clade 2.3.4.4 b được tổng hợp chi tiết ở phụ lục 12 và biểu diễn ở hình 4.24.
Qua theo dõi thí nghiệm cho thấy:
Gà đối chứng đều khỏe mạnh, tăng trọng tốt và không có bất cứ biểu hiện bất thường nào. Trong khi tất cả gà gây bệnh thực nghiệm với virus CGC chết với tỷ lệ 100% vào ngày thứ 5, cụ thể:
Gà gây nhiễm virus H5N1 clade 2.3.2.1c có điểm lâm sàng trung bình cao nhất là 2.72, một nửa số gà gây nhiễm virus có biểu hiện triệu chứng bệnh vào ngày đầu tiên sau CCĐ với triệu chứng: sốt cao, ủ rũ, mệt mỏi, chảy nước mắt, nước mũi, thở khò khè, vảy mỏ. Có 2/10 gà chết đột ngột không quan sát thấy triệu chứng lâm sàng. 70% (7/10 con) số gà chết vào ngày thứ 2 và 30% (3/10 con) còn lại chết vào ngày thứ 3. Như vậy, gà có biểu hiện triệu chứng rất sớm và chết nhanh, tỷ lệ chết 100% sau 3 ngày CCĐ.
Gà gây nhiễm virus CGC H5N6 clade 2.3.4.4 a có điểm lâm sàng trung bình thấp nhất là 2.29, diễn biến về biểu hiện lâm sàng chậm. Gà bắt đầu có biểu hiện triệu chứng vào ngày thứ 2 sau gây bệnh với tỷ lệ 30% (3/10 con), 70% gà đến ngày thứ 3 mới biểu hiện triệu chứng. Các triệu chứng gồm: ủ rũ, mệt mỏi, nước mắt, nước mũi chảy, thở khò khè, vảy mỏ, gà phải rướn cao mỏ để thở, mắt bị viêm, mặt phù nề, mào tích tím tái dày lên do thủy thũng, dưới da vùng chân có xuất huyết. Ngoài ra, gia cầm còn có biểu hiện thần kinh như run rẩy, đi không vững, ủ rũ, nằm li bì tụ đống với nhau, một số bãi phân và lẫn máu. Gà chết nhiều nhất vào ngày thứ 4 với tỷ lệ 60% (6/10 con) và đạt đến 100% vào ngày thứ 5.
Gà gây nhiễm virus CGC H5N6 clade 2.3.4.4b có điểm lâm sàng trung bình là 2.50, các biểu hiện lâm sàng biểu hiện tương tự nhưng xảy ra chậm hơn so với gà gây nhiễm virus H5N1 clade 2.3.2.1c và nhanh hơn so với gà gây nhiễm virus H5N1 clade 2.3.4.4a.
Qua kết quả trên cho thấy các virus H5N1 2.3.2.1c, H5N6 2.3.4.4a, 2.3.4.4b