Phản ứng Realtime RT-PCR để sàng lọc, phát hiện virus cúm A/H5Nx

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.2. Phản ứng Realtime RT-PCR để sàng lọc, phát hiện virus cúm A/H5Nx

Phản ứng Realtime RT-PCR được sử dụng để phát hiện virus cúm type A, mẫu dương tính với virus cúm type A tiếp tục được kiểm tra subtype H5. Mẫu dương tính với H5 tiếp tục được kiểm tra với N1 và N6 bằng các cặp mồi tương ứng.

3.3.2.1. Phương pháp tách chiết ARN

Các mẫu dịch hầu họng trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và tách chiết ARN bằng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất (phụ lục 1).

3.3.2.2. Phương pháp Realtime RT-PCR xác định virus cúm A/H5N1 và A/H5N6

Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (rRT-PCR) sử dụng các cặp mồi và probe (bảng 3.2) được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, A/H5N6 và hỗn hợp phản ứng theo quy trình chẩn đốn – TCVN 8400-26:2014 (phụ lục 2).

Bảng 3.2. Danh mục primer và probe để xác định virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 Primer/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu

5’ 3’

M

Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1 Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA

Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA

H5

Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1 Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G

Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC

N1

Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1

Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C

N6

Probe CCA ATA ACA GGA GGG AGCCCAGACCC FAM BHQ1 Xuôi CCC CAC CAA TGG GAA CTG

Ngược TCT AGG AAT GCA AAC CCT TTT ACC

Trong đó:

Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì

3.3.2.3. Phương pháp RT-PCR định type, subtype virus cúm gia cầm

Phương pháp RT-PCR được sử dụng để định type H5N1 hoặc H5N6 trong trường hợp phương pháp rRT-PCR không xác định được. Các huyễn dịch bệnh phẩm hoặc dịch hầu họng được tách chiết ARN bằng Rneasy Mini Kit (250) QIAGEN Cat. 74106 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phương pháp RT-PCR định type cúm A (gen M), subtype H5 và xác định subtype NA được thực hiện với kít SuperScript III Platinum One-Step RT-PCR, Invitrogen 12574-026 và các cặp mồi đặc hiệu gen M, H5, N1 (Fouchier & cs., 2000; Tsukamoto & cs., 2008) và N6 (Tsukamoto & cs., 2009). Các cặp mồi phát hiện được gen M, H5, N1 và N6 liệt kê trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Danh mục các cặp mồi phát hiện gen M, H5, N1 và N6

Gen Vị trí

sequence

Gen HA chuẩn

Kích

thước Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)

M H5-918F Không công bố 244 CTTCTAACCGAGGTCGAAACG H5-1166 AGGGCATTTTGGACAAAG/TCGTCTA H5 H5-918F U69277 249 CCARTRGGKGCKATAAAYTC H5-1166 KGTCTGCWGCRTAYCCRCTY N1 N1-54F CY003931 245 TCARTCTGYATGRYAAYTGG N1-298R GGRCARAGAGAKGAATTGCC N6 N6-57F CY005464 264 AGGAATGACACTATCSGTAGTAAG N6-307R GAYAGRATRTGCCATGAGTTYAC

Mã ký hiệu những bazơ nitric hỗn hợp: B, C/G/T; D, A/G/T; K, G/T; M, A/C; R, A/G; V, A/C/G; W, A/T; Y, C/T.

3.3.2.4. Phương pháp giải trình tự gen và phân tích phả hệ

Giải trình tự gen được thực hiện với các mẫu virus dương tính H5. Giải trình tự gen HA, các đoạn gen HA1 và HA2 của virus được khuyếch đại bằng kit Platium PCR Supermix, Invitrogen 11306-016 với 2 cặp mồi đặc hiệu gen HA1 và HA2 (bảng 3.3) (Hoffmann & cs., 2001). Tất cả các mồi xuôi và ngược được gắn với đoạn trình tự M13 (bảng 3.4, chữ đậm) tương ứng để làm thuận lợi cho việc giải trình tự gen:

Bảng 3.4. Danh mục trình tự mồi giải trình tự gen HA1 và HA2

Cặp mồi Tên Trình tự mồi

Cặp 1

S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA

AGC AGG GGT YTA AT

S18_H5-1111R CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC

AAC CAT CTA YCA TTC C

Cặp 2

S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT

AYA ARA TTG TCA AG

S20_H5-R1773

CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA

ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT

Các phản ứng giải trình tự theo 2 chiều (xuôi, ngược) được thực hiện tại Macrogen, Inc (Seoul, Hàn Quốc). Các trình tự gen HA1 và HA2 được ráp nối trong Bioedit version 7.2.5 thành các trình tự gen HA đầy đủ, khoảng 1700 bp.

Cây phả hệ gen H5 của các virus trong nghiên cứu này và các virus tham chiếu trong ngân hàng gen (GenBank), GISAID, dữ liệu của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương (NCVD) xây dựng để phân tích bằng phần mềm MEGA 7, phương pháp Neighbor - Joining, mơ hình Kimura 2-parameter, độ tin cậy của phân tích phả hệ được kiểm tra bằng phân tích bootstrap 1000 lần lặp lại. Các nhánh phả hệ có giá trị boostrap ≥ 95 là đáng tin cậy. Mức độ tương đồng nucleotide giữa các gen được tính tốn bằng cơng cụ Sequence identity matrix trong phần mềm Bioedit.

3.3.2.5. Phương pháp phân loại clade

Các virus cúm H5 được phân loại theo tiêu chí định nghĩa clade của nhóm Nghiên cứu tiến hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO. Một clade/subclade mới được xác định dựa trên đặc điểm phân nhánh của cây phả hệ gen H5 (tree topology) và một số tiêu chí sau: (1) phải có ít nhất 4 chủng virus cùng chung một nút (node), (2) khoảng cách trung bình nucleotide (Kimura 2-parameter) bên trong nhóm < 1,5% và giữa các nhóm > 1,5%, (3) giá trị bootstrap (1000 lần neigbour- joining bootstrap) tại điểm nút xác định clade ≥ 60 (Smith & Donis, 2015).

3.3.2.6. Phương pháp nghiên sự phân bố virus cúm theo không gian và thời gian

Sự xuất hiện của các virus được phân tích gắn với thời gian xuất hiện ổ dịch tương ứng. Bản đồ phân bố theo không gian của các virus xuất hiện được vẽ bằng phần mềm Quantum Gis (Hugentobler, 2008).