Phần 5 Kết luận và đề nghị
3.1. Cơ cấu thu thập mẫu của đề tài
TT Đối tượng lấy mẫu Số mẫu lấy Số chợ/hộ Số tháng/ giai đoạn Số tỉnh Số mẫu thu thập 1 Gà, vịt tại chợ 30 3 24 9 19.440 2 Chim cút tại các hộ chăn nuôi 10 5 24 9 10.800 3 Gà, ngan/vịt, chim cút 150 2015-2018 2 300 Tổng 30.540
Các mẫu sau khi thu thập sẽ được bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2-8oC và vận chuyển đến Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương để xét nghiệm sàng lọc virus cúm type A bằng phương pháp rRT-PCR theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-26:2014.
+ Phương pháp lấy mẫu dịch hầu họng
Dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong hầu họng của gà, vịt, chim cút và ngoáy nhẹ nhàng trên bề mặt niêm mạc; lấy tăm bơng ra sau đó cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch bảo quản, đưa vào thùng bảo quản lạnh gửi về phòng thí nghiệm trong vịng 48 giờ kể từ khi lấy mẫu;
Mẫu bảo quản ở 40C từ 1 - 2 ngày, nếu mẫu chưa được kiểm tra cần bảo quản ở tủ âm -200C, và chuyển tới phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt. Mẫu có phiếu ghi bệnh phẩm kèm theo.
+ Phương pháp lấy mẫu máu
Sử dụng kim tiêm vô trùng lấy 3 - 5 ml máu tĩnh mạch cánh của gà, vịt và chim cút, chuyển vào ống chứa, để đông, giữ tại 40C trong vòng 24 giờ. Huyết thanh được tách chiết như sau:
- Đóng chặt ống chứa máu, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Huyết thanh và tế bào máu sẽ được phân tách trong ống;
- Dùng pipet vô trùng, nhẹ nhàng hút huyết thanh ở phần trên của ống chuyển sang ống sạch, bảo quản ở 40C.
Mổ khám gia cầm nhằm xác định các biến đổi đại thể trong các cơ quan, tổ chức của gia cầm mắc CGC. Gia cầm được cắt tiết, bộc lộ và tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch, tim, gan, lách, thận… theo các mục đích nghiên cứu khác nhau.
3.3.2. Phản ứng Realtime RT-PCR để sàng lọc, phát hiện virus cúm A/H5Nx
Phản ứng Realtime RT-PCR được sử dụng để phát hiện virus cúm type A, mẫu dương tính với virus cúm type A tiếp tục được kiểm tra subtype H5. Mẫu dương tính với H5 tiếp tục được kiểm tra với N1 và N6 bằng các cặp mồi tương ứng.
3.3.2.1. Phương pháp tách chiết ARN
Các mẫu dịch hầu họng trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và tách chiết ARN bằng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất (phụ lục 1).
3.3.2.2. Phương pháp Realtime RT-PCR xác định virus cúm A/H5N1 và A/H5N6
Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (rRT-PCR) sử dụng các cặp mồi và probe (bảng 3.2) được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, A/H5N6 và hỗn hợp phản ứng theo quy trình chẩn đốn – TCVN 8400-26:2014 (phụ lục 2).
Bảng 3.2. Danh mục primer và probe để xác định virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 Primer/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
5’ 3’
M
Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1 Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA
Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA
H5
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1 Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G
Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC
N1
Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1
Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C
N6
Probe CCA ATA ACA GGA GGG AGCCCAGACCC FAM BHQ1 Xuôi CCC CAC CAA TGG GAA CTG
Ngược TCT AGG AAT GCA AAC CCT TTT ACC
Trong đó:
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì
3.3.2.3. Phương pháp RT-PCR định type, subtype virus cúm gia cầm
Phương pháp RT-PCR được sử dụng để định type H5N1 hoặc H5N6 trong trường hợp phương pháp rRT-PCR không xác định được. Các huyễn dịch bệnh phẩm hoặc dịch hầu họng được tách chiết ARN bằng Rneasy Mini Kit (250) QIAGEN Cat. 74106 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phương pháp RT-PCR định type cúm A (gen M), subtype H5 và xác định subtype NA được thực hiện với kít SuperScript III Platinum One-Step RT-PCR, Invitrogen 12574-026 và các cặp mồi đặc hiệu gen M, H5, N1 (Fouchier & cs., 2000; Tsukamoto & cs., 2008) và N6 (Tsukamoto & cs., 2009). Các cặp mồi phát hiện được gen M, H5, N1 và N6 liệt kê trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Danh mục các cặp mồi phát hiện gen M, H5, N1 và N6
Gen Vị trí
sequence
Gen HA chuẩn
Kích
thước Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)
M H5-918F Khơng cơng bố 244 CTTCTAACCGAGGTCGAAACG H5-1166 AGGGCATTTTGGACAAAG/TCGTCTA H5 H5-918F U69277 249 CCARTRGGKGCKATAAAYTC H5-1166 KGTCTGCWGCRTAYCCRCTY N1 N1-54F CY003931 245 TCARTCTGYATGRYAAYTGG N1-298R GGRCARAGAGAKGAATTGCC N6 N6-57F CY005464 264 AGGAATGACACTATCSGTAGTAAG N6-307R GAYAGRATRTGCCATGAGTTYAC
Mã ký hiệu những bazơ nitric hỗn hợp: B, C/G/T; D, A/G/T; K, G/T; M, A/C; R, A/G; V, A/C/G; W, A/T; Y, C/T.
3.3.2.4. Phương pháp giải trình tự gen và phân tích phả hệ
Giải trình tự gen được thực hiện với các mẫu virus dương tính H5. Giải trình tự gen HA, các đoạn gen HA1 và HA2 của virus được khuyếch đại bằng kit Platium PCR Supermix, Invitrogen 11306-016 với 2 cặp mồi đặc hiệu gen HA1 và HA2 (bảng 3.3) (Hoffmann & cs., 2001). Tất cả các mồi xuôi và ngược được gắn với đoạn trình tự M13 (bảng 3.4, chữ đậm) tương ứng để làm thuận lợi cho việc giải trình tự gen:
Bảng 3.4. Danh mục trình tự mồi giải trình tự gen HA1 và HA2
Cặp mồi Tên Trình tự mồi
Cặp 1
S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA
AGC AGG GGT YTA AT
S18_H5-1111R CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC
AAC CAT CTA YCA TTC C
Cặp 2
S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT
AYA ARA TTG TCA AG
S20_H5-R1773
CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA
ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT
Các phản ứng giải trình tự theo 2 chiều (xuôi, ngược) được thực hiện tại Macrogen, Inc (Seoul, Hàn Quốc). Các trình tự gen HA1 và HA2 được ráp nối trong Bioedit version 7.2.5 thành các trình tự gen HA đầy đủ, khoảng 1700 bp.
Cây phả hệ gen H5 của các virus trong nghiên cứu này và các virus tham chiếu trong ngân hàng gen (GenBank), GISAID, dữ liệu của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương (NCVD) xây dựng để phân tích bằng phần mềm MEGA 7, phương pháp Neighbor - Joining, mơ hình Kimura 2-parameter, độ tin cậy của phân tích phả hệ được kiểm tra bằng phân tích bootstrap 1000 lần lặp lại. Các nhánh phả hệ có giá trị boostrap ≥ 95 là đáng tin cậy. Mức độ tương đồng nucleotide giữa các gen được tính tốn bằng cơng cụ Sequence identity matrix trong phần mềm Bioedit.
3.3.2.5. Phương pháp phân loại clade
Các virus cúm H5 được phân loại theo tiêu chí định nghĩa clade của nhóm Nghiên cứu tiến hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO. Một clade/subclade mới được xác định dựa trên đặc điểm phân nhánh của cây phả hệ gen H5 (tree topology) và một số tiêu chí sau: (1) phải có ít nhất 4 chủng virus cùng chung một nút (node), (2) khoảng cách trung bình nucleotide (Kimura 2-parameter) bên trong nhóm < 1,5% và giữa các nhóm > 1,5%, (3) giá trị bootstrap (1000 lần neigbour- joining bootstrap) tại điểm nút xác định clade ≥ 60 (Smith & Donis, 2015).
3.3.2.6. Phương pháp nghiên sự phân bố virus cúm theo không gian và thời gian
Sự xuất hiện của các virus được phân tích gắn với thời gian xuất hiện ổ dịch tương ứng. Bản đồ phân bố theo không gian của các virus xuất hiện được vẽ bằng phần mềm Quantum Gis (Hugentobler, 2008).
3.3.3. Giám định virus phân lập bằng phương pháp HI
* Giám định bằng phương pháp HA để xác định các mẫu có chứa virus gây ngưng kết hồng cầu (đặc trưng gây bệnh của virus cúm A), các mẫu cho phản ứng HA âm tính khơng chứa virus CGC.
- Chuẩn bị: hồng cầu gà 1%, dịch môi trường sau khi phân lập trên tế bào hoặc dịch niệu mô sau khi phân lập trên trứng; kháng nguyên chuẩn CGC H5N1;
- Phương pháp tiến hành:
+ Cho 25 µl PBS pH ~7,2 vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 12. Cho 25 µl dịch mơi trường sau khi phân lập trên tế bào, dung dịch niệu mô sau khi phân lập trên trứng hoặc kháng nguyên chuẩn vào giếng 1;
+ Trộn đều huyễn dịch hoặc kháng nguyên với PBS ở giếng 1, hút 25 µl từ giếng 1 chuyển sang giếng 2 và trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng 3 và trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11, hút bỏ 25 µl ở giếng 11. Giếng 12 chỉ có PBS để làm đối chứng hồng cầu;
+ Cho 25 µl hồng cầu gà 1 % vào mỗi giếng, lắc nhẹ trên máy lắc trong 1 phút. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 30 phút.
- Đánh giá kết quả:
+ Phản ứng HA dương tính khi có hạt ngưng kết lấm chấm ở độ pha lỗng (hiệu giá) ≥ 1/4;
+ Phản ứng HA âm tính khi khơng có ngưng kết hồng cầu hoặc có ngưng kết nhưng ở độ pha loãng < 1/4;
+ Những mẫu dương tính với phản ứng HA là những mẫu có chứa virus gây ngưng kết hồng cầu;
+ Hiệu giá HA của một mẫu được xác định tại nồng độ pha lỗng cao nhất có ngưng kết hồng cầu. Ví dụ mẫu có phản ứng HA dương tính ở độ pha lỗng 1/1024 thì hiệu giá HA của mẫu được xác định là 1/1024 hoặc 10 log2 (phụ lục 3).
* Phân tích kháng nguyên của virus cúm A/H5 biến chủng mới được thực hiện thông qua phản ứng HI chéo sử dụng kháng huyết thanh gà đồng chủng và dị chủng thuộc các clade; 2.3.2.1c, 2.3.4.4a và 2.3.4.4b.
- Chuẩn bị: để loại bỏ yếu tố ngưng kết không đặc hiệu, các kháng huyết thanh được bất hoạt ở 560C trong 30 phút, rồi hấp phụ với hồng cầu gà theo tỉ lệ 0,5 ml huyết thanh/0,025 ml hồng cầu, trộn đều và để trong 30 phút, Phản ứng HI
được thực hiện theo hướng dẫn của OIE (phụ lục 4). - Phương pháp tiến hành:
+ Cho 25 µl PBS pH ~7,2 vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 12. Cho 25 µl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1;
+ Trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng 2, chuyển 25 µl sang giếng 3 và trộn đều, chuyển 25 µl sang giếng 4, tiếp tục đến giếng 11, hút bỏ 25 µl ở giếng 11;
+ Cho 25 µl kháng nguyên 4 HA/25 µl vào các giếng từ 1 đến 11. Cho thêm 25 µl PBS vào giếng 12 làm đối chứng hồng cầu;
+ Lắc nhẹ trên máy lắc sau đó để đĩa ở nhiệt độ phịng 30 phút;
+ Cho 25 µl hồng cầu gà 1 % vào mỗi giếng, lắc nhẹ trong 1 phút. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Đọc kết quả sau 30 phút
- Đánh giá kết quả: hiệu giá HI được xác định bằng đảo nghịch độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh cho kết quả ức chế hoàn toàn ngưng kết hồng cầu.
3.3.4. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của virus A/H5 biến chủng mới
Đặc tính sinh học phân tử của tiểu phần protein HA1 được phân tích, so sánh trong nghiên cứu này, bao gồm:
* Phân tích đặc trưng trình tự amino acid ở gần vị trí cắt HA1-HA2 dựa vào so sánh với motif đã biết trước đây (Senne & cs., 1996). Biểu diễn trình tự amino acid ở gần vị trí cắt bằng phần mềm WebLogo (Crooks & cs., 2004).
* Xác định các vùng kháng nguyên quan trọng ở tiểu phần protein HA1 được thực hiện trên cơ sở (i) so sánh với 5 vùng kháng nguyên đã biết của virus cúm A subtype H15 (Wiley & cs., 1981; Sivay & cs., 2013) và (ii) so sánh với trình tự amino acid tiểu phần tương ứng của virus cúm A clade 1 (GenBank: EF541402) và clade 2.3.4 (GenBank: HM172115). Hai trình tự tham chiếu kể trên được chọn dựa theo nghiên cứu đã công bố (Connie Leung & cs., 2013). Phần mềm COBALT (Papadopoulos & Agarwala, 2007) được dùng để dóng hàng (alignment) trong so sánh trình tự amino acid giữa các clade. Xác định vị trí 5 vùng kháng nguyên A- E của virus cúm A/H5Nx được dựa theo công bố trước đây (Liu & cs., 2016).
* Phân tích hiện tượng glycosyl hóa: sử dụng phần mềm NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) để dự đốn trình tự đặc hiệu N-X- S/T (N = Asparagin; X = amino acid bất kỳ, trừ Prolin; S/T = Serin hoặc
Threonin), ở đó xảy ra hiện tượng gắn gốc đường vào amino acid Asparagin.
3.3.5. Phương pháp xác định chỉ số độc lực của virus A/H5 biến chủng mới
Nội dung đánh giá chỉ số độc lực IVPI của virus CGC trong khuôn khổ đề tài được thực hiện đối với các biến chủng H5N1 clade 2.3.2.1c, biến chủng H5N6 clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b tương ứng lần lượt là: H5N1 clade 2.3.2.1c
(A/Ck/VN/KienGiang/NCVD-15A7/2015(H5N1)), virus H5N6 clade 2.3.4.4a
(A/ck/VN/QuangNgai/NCVD-16A37/2016(H5N6)) và virus H5N6 clade 2.3.4.4b (A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6)). Virus được nhân giống, chuẩn độ và gây nhiễm vào gà 6 tuần tuổi qua đường tiêm tĩnh mạch với liều 106TCID50/100 µl/con.
a. Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm trên gà được thực hiện như sau:
Số gà được sử dụng gồm 45 con chia làm 3 nhóm. Mỗi nhóm gồm lơ gây nhiễm 10 con và lô đối chứng không gây nhiễm 5 con (bảng 3.5). Gà được nuôi từ lúc 1 ngày tuổi đến khi được 6 tuần tuổi. Trước khi tiến hành thí nghiệm, tất cả gà được lấy mẫu huyết thanh để kiểm tra kháng thể kháng cúm H5 và mẫu dịch hầu họng để kiểm tra virus cúm type A, đảm bảo gà khơng có kháng thể kháng virus cúm H5. Sau đó, tiến hành tiêm virus vào tĩnh mạch của gà ở các lô gây nhiễm (OIE,2012). Các lô đối chứng nuôi cách ly với lô gây nhiễm. Liều gây nhiễm là 106 TCID50/100 µl/con, theo đường tĩnh mạch.
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm cơng cường độc Chủng virus Gà thí nghiệm (con) H5N1 clade 2.3.2.1c H5N6 clade 2.3.4.4a H5N6 clade 2.3.4.4b
Lô gây nhiễm 10 10 10
Lô đối chứng 5 5 5
Tổng 15 15 15
Theo dõi gà trong vòng 10 ngày sau khi gây nhiễm, chấm điểm lâm sàng hằng ngày theo tiêu chí đánh giá của OIE về thử nghiệm độc lực virus CGC (OIE, 2012).
Khi gà chết, tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng để xét nghiệm virus nhằm xác nhận nguyên nhân chết bằng phương pháp rRT-PCR. Giá trị Ct ≥ 35 được coi là âm tính virus.
b. Cơng thức tính chỉ số độc lực IVPI
- Cách tính điểm lâm sàng theo hướng dẫn của OIE:
Điểm Tiêu chí
0 Gà khỏe mạnh bình thường, khơng có triệu chứng của cúm gia cầm.
1 Gà biểu hiện 1 trong các triệu chứng của cúm gia cầm như: ủ rũ, mệt mỏi, xù lơng; triệu chứng hơ hấp; ỉa chảy; tím tái; phù đầu, mặt; triệu chứng thần kinh. 2 Gà có từ 2 triệu chứng đặc trưng của cúm gia cầm.
3 Gà chết. Những ngày sau khi chết được tính 3 điểm đến hết thời gian theo dõi - Chỉ số độc lực IVPI là giá trị trung bình điểm lâm sàng hằng ngày của các cá thể trong lơ thí nghiệm trong 10 ngày theo dõi. Chỉ số IVPI = 3 có nghĩa là tất cả động vật thí nghiệm chết trong vịng 24 giờ; chỉ số IVPI = 0 có nghĩa là khơng có triệu chứng lâm sàng xuất hiện ở tất cả động vật trong thời gian theo dõi 10 ngày.
- Theo quy định của OIE, chủng virus cúm nào cho chỉ số IVPI > 1,2 thì được xếp vào nhóm độc lực cao.
c. Cơng thức tính thời gian chết trung bình
Động vật thí nghiệm được theo dõi sau mỗi 12 giờ đến khi chết. Thời gian chết trung bình (MDT) là khoảng thời gian trung bình từ khi gây nhiễm đến khi chết của những động vật chết trong lơ thí nghiệm.
Số con chết x thời gian chết MDT (h) =
Tổng số con chết
3.3.6. Phương pháp đánh giá triệu chứng lâm sàng
- Gà 6 tuần tuổi, khơng có kháng thể kháng virus cúm H5 được chia thành 3 lô, mỗi lô 10 con gây bệnh thực nghiệm với virus CGC và một lô 15 con làm đối chứng được nuôi cách ly với lô gây bệnh (bảng 3.4).
- Ba chủng virus CGC phân lập năm 2015-2016 gồm H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b tương ứng lần lượt.là: H5N1 clade 2.3.2.1c