Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.5. Phương pháp xác định chỉ số độc lực của virus A/H5 biến chủng mới
Nội dung đánh giá chỉ số độc lực IVPI của virus CGC trong khuôn khổ đề tài được thực hiện đối với các biến chủng H5N1 clade 2.3.2.1c, biến chủng H5N6 clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b tương ứng lần lượt là: H5N1 clade 2.3.2.1c
(A/Ck/VN/KienGiang/NCVD-15A7/2015(H5N1)), virus H5N6 clade 2.3.4.4a
(A/ck/VN/QuangNgai/NCVD-16A37/2016(H5N6)) và virus H5N6 clade 2.3.4.4b (A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6)). Virus được nhân giống, chuẩn độ và gây nhiễm vào gà 6 tuần tuổi qua đường tiêm tĩnh mạch với liều 106TCID50/100 µl/con.
a. Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm trên gà được thực hiện như sau:
Số gà được sử dụng gồm 45 con chia làm 3 nhóm. Mỗi nhóm gồm lơ gây nhiễm 10 con và lô đối chứng không gây nhiễm 5 con (bảng 3.5). Gà được nuôi từ lúc 1 ngày tuổi đến khi được 6 tuần tuổi. Trước khi tiến hành thí nghiệm, tất cả gà được lấy mẫu huyết thanh để kiểm tra kháng thể kháng cúm H5 và mẫu dịch hầu họng để kiểm tra virus cúm type A, đảm bảo gà khơng có kháng thể kháng virus cúm H5. Sau đó, tiến hành tiêm virus vào tĩnh mạch của gà ở các lô gây nhiễm (OIE,2012). Các lô đối chứng nuôi cách ly với lô gây nhiễm. Liều gây nhiễm là 106 TCID50/100 µl/con, theo đường tĩnh mạch.
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm cơng cường độc Chủng virus Gà thí nghiệm (con) H5N1 clade 2.3.2.1c H5N6 clade 2.3.4.4a H5N6 clade 2.3.4.4b
Lô gây nhiễm 10 10 10
Lô đối chứng 5 5 5
Tổng 15 15 15
Theo dõi gà trong vòng 10 ngày sau khi gây nhiễm, chấm điểm lâm sàng hằng ngày theo tiêu chí đánh giá của OIE về thử nghiệm độc lực virus CGC (OIE, 2012).
Khi gà chết, tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng để xét nghiệm virus nhằm xác nhận nguyên nhân chết bằng phương pháp rRT-PCR. Giá trị Ct ≥ 35 được coi là âm tính virus.
b. Cơng thức tính chỉ số độc lực IVPI
- Cách tính điểm lâm sàng theo hướng dẫn của OIE:
Điểm Tiêu chí
0 Gà khỏe mạnh bình thường, khơng có triệu chứng của cúm gia cầm.
1 Gà biểu hiện 1 trong các triệu chứng của cúm gia cầm như: ủ rũ, mệt mỏi, xù lông; triệu chứng hơ hấp; ỉa chảy; tím tái; phù đầu, mặt; triệu chứng thần kinh. 2 Gà có từ 2 triệu chứng đặc trưng của cúm gia cầm.
3 Gà chết. Những ngày sau khi chết được tính 3 điểm đến hết thời gian theo dõi - Chỉ số độc lực IVPI là giá trị trung bình điểm lâm sàng hằng ngày của các cá thể trong lơ thí nghiệm trong 10 ngày theo dõi. Chỉ số IVPI = 3 có nghĩa là tất cả động vật thí nghiệm chết trong vịng 24 giờ; chỉ số IVPI = 0 có nghĩa là khơng có triệu chứng lâm sàng xuất hiện ở tất cả động vật trong thời gian theo dõi 10 ngày.
- Theo quy định của OIE, chủng virus cúm nào cho chỉ số IVPI > 1,2 thì được xếp vào nhóm độc lực cao.
c. Cơng thức tính thời gian chết trung bình
Động vật thí nghiệm được theo dõi sau mỗi 12 giờ đến khi chết. Thời gian chết trung bình (MDT) là khoảng thời gian trung bình từ khi gây nhiễm đến khi chết của những động vật chết trong lơ thí nghiệm.
Số con chết x thời gian chết MDT (h) =
Tổng số con chết