Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.3. Khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của các loạ
4.3.3. Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.3.4.4b
4.3.3.1. Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch cho gà và vịt
Ba tuần sau khi gây miễn dịch, lấy mẫu máu để kiểm tra hàm lượng kháng thể, kết quả được tóm tắt ở hình 4.34 dưới đây.
Hình 4.34. Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch cho gà và vịt trong thí nghiệm cơng cường độc bằng virus clade 2.3.4.4b
Tương đồng với kết quả đợt gây miễn dịch được thực hiện trước đó (mục 4.3.2 và 4.3.3), miễn dịch được tạo ra ở gà và vịt sử dụng virus clade 1 (vacxin
Navet-vifluvac) và clade 2.3.4 (vacxin Re-5) đều có hiệu giá kháng thể trung bình ở trên ngưỡng bảo hộ (đường nét đứt màu đỏ, hình 4.35). Cụ thể: ở gà hiệu giá kháng thể lần lượt là 4,7 log2 và 7,8 log2; và ở vịt (sau khi được miễn dịch nhắc lại) là 8,3 log2 và 8,7 log2.
4.3.3.2. Kết quả công cường độc với virus cúm H5N6 clade 2.3.4.4b
Kết quả thử nghiệm khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.4.4b ở nhóm gà, vịt có miễn dịch dị chủng (hình 4.34) được thể hiện trước hết thông qua theo dõi tỷ lệ chết sau cơng cường độc (hình 4.35).
Nhóm gà đối chứng (khơng có miễn dịch) xuất hiện triệu chứng sớm (1 ngày sau cơng cường độc). Tồn bộ gà đối chứng công cường độc bằng virus H5N6 clade 2.3.4.4b chết trong vòng 9 ngày. Trái lại, ở nhóm có miễn dịch dị chủng (clade 1 hoặc clade 2.3.4), thời gian xuất hiện triệu chứng muộn hơn (clade 1), diễn biến chậm hơn (clade 2.3.4) sau cơng cường độc, cụ thể: nhóm gà tiêm vacxin Navet-vifluvac sau 4 ngày đầu tiên khơng có triệu chứng nào được ghi nhận, đến ngày thứ 5 có 3/10 gà có biểu hiện ốm (liệt chân, khó thở, nhiều dịch mũi). Gà nhiễm bệnh lần lượt chết vào ngày thứ 6, 7 và 8 sau công cường độc với bệnh tích đặc trưng của bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao. Những gà cịn lại khơng có biểu hiện bệnh. Tỷ lệ sống sót của nhóm sau 10 ngày theo ngày theo dõi là 70% (hình 4.35A).
Đối với nhóm gà tiêm vacxin Re-5: tiến triển bệnh ở nhóm này nhanh hơn nhóm vacxin Navet-vifluvac. Ngay ngày thứ nhất có 1 gà có biểu hiện ốm sau đó gà chết vào ngày thứ 2. Cùng lúc đó có thêm 2 gà khác xuất hiện triệu chứng ốm nhẹ, triệu chứng tăng dần trong những ngày tiếp theo như không thể đi lại, chảy nhiều nước mắt, nước mũi, mào tím tái và bị phù vùng đầu, 2 gà này chết vào ngày thứ 5 và 7 sau công cường độc. Cịn lại 7/10 gà khác khơng có biểu hiện bệnh và sống sót sau 10 ngày theo dõi (hình 4.35A). Kết quả so sánh về tiến triển bệnh giữa nhóm gà khơng có miễn dịch và nhóm gà có miễn dịch (trình bày ở hình 4.35A) cho thấy chủng virus clade 2.3.4.4b vẫn có khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng tạo ra bởi clade 1 và clade 2.3.4.
Hình 4.35. Khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.4.4b ở gà và vịt có đáp ứng miễn dịch dị chủng
Nhóm vịt đối chứng sau 3- 4 ngày gây nhiễm virus H5N6 clade 2.3.4.4b, một số vịt bắt đầu có biểu hiện mệt mỏi, ủ rũ, kém ăn. Thời gian bị bệnh của vịt kéo dài
hơn nhiều so với gà, cá biệt có những con ốm 6-7 ngày mới chết. Ngồi ra một số vịt cũng có biểu hiện nhiễm bệnh nhẹ, nhưng chỉ kéo dài 3- 4 ngày rồi triệu chứng bệnh mất đi, con vật hồi phục và sống sót sau 10 ngày theo dõi. Tổng số vịt chết sau công cường độc là 8/10 con, tỷ lệ chết là 80%. Nhóm vịt tiêm vacxin Navet- vifluvac: trong thời gian theo dõi 10 ngày, có 3/10 vịt được gây nhiễm virus có biểu hiện lâm sàng nhẹ, chỉ thấy ủ rũ, chảy nước mũi nhẹ, giảm ăn. Triệu chứng kéo dài từ 2- 5 ngày rồi hết, vịt vẫn sống sót đến khi kết thúc thí nghiệm. Nhóm vịt tiêm vacxin Re-5: trong thời gian từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 9 sau cơng cường độc, có 2/10 vịt xuất hiện triệu chứng lâm sàng nhẹ. Tuy nhiên vịt khơng có tiến triển bệnh nặng hơn và vẫn sống sót sau 10 ngày theo dõi (hình 4.35B).
Như vậy, đáp ứng miễn dịch tạo ra bởi clade 1 (vacxin Navet-vifluvac) và clade 2.3.4 (vacxin Re-5) có khả năng bảo hộ lâm sàng chống lại virus H5N6 clade 2.3.4.4b với tỷ lệ 70% ở gà và bảo hộ 100% ở vịt. Ngược lại, có thể nhận xét khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng để gây bệnh thể lâm sàng của virus clade 2.3.4.4b cao hơn ở gà (sống sót 70%) so với ở vịt (sống sót 100%).
4.3.3.3. Kết quả xét nghiệm virus clade 2.3.4.4b bài thải sau công cường độc
Kết quả định lượng virus bài thải trong mẫu dịch hầu họng ở gà và vịt sau thử nghiệm công cường độc với virus clade 2.3.4.4b được trình bày cụ thể ở hình 4.36 và phụ lục 15.
Kết quả định lượng virus bài thải sau công cường độc bằng virus clade 2.3.4.4b cũng phản ánh sự khác biệt rõ giữa nhóm gà và vịt có miễn dịch dị chủng (hình 4.36). Đối với gà có miễn dịch chống lại clade 1 (tiêm vacxin Navet- vifluvac), mẫu dịch hầu họng lấy tại thời điểm 3 ngày sau cơng cường độc có virus cúm ở mức độ rất ít (giá trị Ct trung bình là 34,83 so với ngưỡng dương tính là Ct ≤ 35). Kiểm tra ở ngày 10 sau cơng cường độc, nhóm gà gồm 7/10 gà sống sót về cơ bản khơng cịn bài thải virus (giá trị Ct trung bình nhóm là 36,62), ngoại trừ 1 cá thể vẫn dương tính (Ct = 33,12, hình 4.36A). Đối với gà có miễn dịch chống lại clade 2.3.4 (tiêm vacxin Re-5), mẫu swab hầu họng lấy tại thời điểm 3 ngày sau công cường độc chứa lượng virus bài thải rất nhiều so với nhóm gà được miễn dịch bằng vacxin Navet-vifluvac (Ct trung bình là 27,4). Vào ngày thứ 10 sau công cường độc, có 4/7 gà sống sót của nhóm này tiếp tục bài thải virus (giá trị Ct từ 30,41-32,52, ký hiệu ngơi sao, hình 4.36A). Gà chết sau cơng cường độc (thuộc nhóm có miễn dịch dị chủng bằng clade 1 hoặc clade 2.3.4) bài
thải lượng rất lớn virus (Ct từ 19,81- 25,75; hình 4.36A), gần tương đương với lượng virus bài thải ở nhóm gà đối chứng bị chết sau cơng cường độc (Ct =19,53).
Ghi chú: ngày 3 (D3), ngày 10 (D10), ngày gà chết (Dx) sau công cường độc. Đường nét đứt màu đỏ biểu thị ngưỡng dương tính (Ct ≤ 35) và âm tính (Ct > 35) với virus cúm; * biểu thị số cá thể thải virus trên
tổng số cá thể cịn sống sót tại một thời điểm.
Hình 4.36. Hiện tượng thải virus ở gà và vịt có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau cơng cường độc bằng chủng virus clade 2.3.4.4b
Đối với nhóm vịt có miễn dịch chống lại clade 1 (vacxin Navet-vifluvac), tại cả 2 thời điểm lấy mẫu lúc 3 và 10 ngày sau công cường độc, lượng virus trong mẫu swab đều ở mức rất thấp với giá trị Ct trung bình tương ứng là 35,33 và 36,20 (ngưỡng dương tính có giá trị Ct ≤ 35). Mặc dù vậy, vẫn còn 4/10 vịt thải virus ở nhóm này (ký hiệu ngơi sao, hình 4.37B). Ngược lại, đối với nhóm vịt có miễn dịch chống lại clade 2.3.4 (vacxin Re-5), đều không phát hiện virus bài thải tại thời điểm 3 và 10 ngày sau cơng cường độc (giá trị Ct trung bình lần lượt là 39,56 và 39,88). Đối với nhóm gà, vịt đối chứng tại tất cả các thời điểm lấy mẫu (3, 10 ngày sau công cường độc hoặc tại thời điểm động vật chết) đều phát hiện virus bài thải với giá trị Ct trung bình từ 31,81- 33,34. Những cá thể (vịt, gà) chết, lượng virus bài thải là rất lớn (giá trị Ct trung bình là 21,47). Nhóm gà và vịt khơng công cường độc và được nuôi cách ly, đều không phát hiện virus cúm bài thải ở cả 2 thời điểm lấy mẫu.
So sánh với kết quả của thí nghiệm cơng cường độc bằng clade 2.3.4.4a, thấy rằng virus clade 2.3.4.4b vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng tốt hơn (gây ra hiện tượng mang trùng ở 5/14 gà sống sót và 4/20 vịt sống sót ở ngày thứ 10 sau cơng cường độc).
4.3.4. Biến đổi bệnh lý ở gà có miễn dịch dị chủng sau công cường độc bằng virus clade 2.3.4.4a và clade 2.3.4.4b
Về mặt biến đổi bệnh lý đại thể, kết quả mổ khám cho thấy gà có miễn dịch dị chủng với clade 2.3.4.4a/b sau công cường độc đều giảm mức độ tổn thương giống như ở nhóm gà công cường độc với virus A/H5N1 clade 2.3.2.1c (mục 4.3.1.3). Thêm vào đó, biến đổi bệnh lý đại thể khơng là chỉ tiêu chính để kết luận về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của các clade 2.3.4.4a/b. Nhằm tránh trùng lặp, mô tả về biến đổi bệnh lý liên quan đã khơng được trình bày.
4.3.5. Thảo luận về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của biến thể virus cúm A/H5Nx thể virus cúm A/H5Nx
Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch đồng chủng hoặc dị chủng của các chủng virus cúm gia cầm thể độc lực cao đã được biết tới trong một số nghiên cứu trước đây (Fereidouni & cs., 2009; Costa & cs., 2011). Do vậy, kết quả thu được về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của 3 biến chủng virus cúm A/H5Nx (mục 4.3.4) là phù hợp. Đáng chú ý, khi đánh giá trên cùng nền miễn dịch (clade 1 hoặc clade 2.3.4), ở cùng loài động vật (gà) thấy 3 biến chủng
gây ra tình trạng mang trùng khác nhau. Trong đó, chủng virus clade 2.3.4.4b gây ra tình trạng mang trùng kéo dài (tới ngày thứ 10 sau công cường độc) ở 5/14 gà sống sót (~36%). Khơng những thế, virus thuộc clade này cũng gây ra tình trạng mang trùng ở vịt có miễn dịch dị chủng bởi clade 1 ở 4/10 con sống sót (40%).
Trong điều kiện thí nghiệm, đã có những kết quả nghiên cứu chứng minh khả năng bảo hộ chéo clade (về mặt lâm sàng) của vacxin phòng bệnh cúm gia cầm (Trần Xuân Hạnh, 2016; Hoang & cs., 2020). Mặc dù vậy, kết quả thu được về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của 3 biến thể virus cúm A/H5Nx lưu hành một lần nữa nhấn mạnh sự cần thiết trong việc tạo đáp ứng miễn dịch vô trùng (bảo hộ đồng thời về mặt lâm sàng và hiện tượng mang và thải virus). Để đạt tới trạng thái miễn dịch đó, ngồi các yếu tố về liều kháng nguyên (Kim & cs., 2008), chất bổ trợ (Lu & cs., 2016) cần có chủng virus vacxin phù hợp chủng hiện lưu hành (Connie & cs., 2013; Fallah & cs., 2020) và tính đến đặc điểm đột biến ở protein HA, tại những vị trí quan trọng (Đậu Huy Tùng, 2012).
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1) Giám sát tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới tại 11 tỉnh tỉnh (Hà Nội, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang) giai đoạn 2015-2018:
Virus CGC lưu hành có tỷ lệ dương tính với virus: cúm A (gen M) 9,15 %; A/H5 1,15 %; A/H5N1 0,23%; A/H5N6 0,65%;
Virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được gồm: A/H5N6 subclade 2.3.4.4a/b phân bố ở miền Bắc và miền Trung; A/H5N1 subclade 2.3.2.1c chủ yếu ở miền Nam; chưa phát hiện virus cúm A/H5N6 ở miền Nam;
Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới: cao nhất trên vịt (A/H5N1 0,42%, A/H5N6 1,27% ), tiếp đến là gà (A/H5N1 0,23%, A/H5N6 0,5%), chưa phát hiện biến chủng mới trên chim cút.
2) Đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới
Virus cúm A/H5 biến chủng mới (H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b) phân lập được đều thuộc thể độc lực cao (chỉ số IVPI tương ứng 2,95; 2,78 và 2,87).
Virus cúm A/H5 biến chủng mới mang đặc điểm khác biệt về trình tự amino acid trên gen HA so với chủng virus vacxin (Navet-vifluvac, Re-5) được phép hiện hành ở Việt Nam;
Virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được có tính đặc hiệu với receptor của gia cầm, gây bệnh cúm trên gia cầm với các biểu hiện đặc trưng của bệnh CGC gồm: (1) triệu chứng lâm sàng như sốt cao, ủ rũ, mệt mỏi, chảy nước mắt, nước mũi, thở khị khè; (2) biến đổi bệnh tích gồm phù, sung huyết, xuất huyết và hoại tử ở hầu hết các cơ quan phủ tạng.
3) Khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của các loại vacxin hiện hành
Đáp ứng miễn dịch dị chủng từ vacxin Navet-vifluvac và Re-5 đối với các biến chủng (clade 2.3.2.1c; clade 2.3.4.4a; clade 2.3.4.4b): (1) tạo được miễn dịch trên ngưỡng bảo hộ (>4log2); (2) không tạo ra trạng thái miễn dịch vơ trùng; (3) có khả năng bảo hộ lâm sàng 50- 80% gà và 100% vịt thí nghiệm;
Gà được gây miễn dịch dị chủng từ Navet-vifluvac và Re-5 có xu hướng giảm bài thải virus cường độc và biến đổi bệnh tích đại thể (chỉ có bệnh tích: ở phổi với Navet-vifluvac; ở phổi, gan, cơ và ruột với Re-5);
Virus H5N6 clade 2.3.4.4b vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng tốt hơn (gây tình trạng mang trùng và tỷ lệ chết cao hơn cho động vật thí nghiệm) virus H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N1 clade 2.3.2.1c;
Vacxin Navet-vifluvac bảo hộ lâm sàng cho gà (70-80%) chống lại virus cúm A/H5 biến chủng mới tốt hơn vacxin Re-5 (50-70%).
5.2. ĐỀ NGHỊ
1) Tìm hiểu thêm về các subtype H5Nx và các Subtype HA khác. Tiếp tục các chương trình giám sát để theo dõi sự lây lan, tiến hóa của các virus H5, clade 2.3.4.4.
2) Tiếp tục nghiên cứu về độc lực của các virus cúm thuộc các nhánh khác nhau đối với các loại gia cầm khác.
3) Nghiên cứu phát triển các vacxin sử dụng chủng H5N6 clade 2.3.4.4a/b và H5N1 clade 2.3.2.1c. Tiếp tục nghiên cứu về lưu hành biến chủng virus cúm để kịp thời có điều chỉnh cơng thức vacxin nhằm tạo ra đáp ứng miễn dịch vô trùng ở gia cầm được tiêm vacxin phòng bệnh.
4) Cần tiếp tục làm rõ một số khía cạnh khác như: ảnh hưởng của lượng kháng thể, lượng kháng nguyên gây miễn dịch và loài động vật thí nghiệm (gà/ vịt), v.v...trong các thí nghiệm đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin.
Phụ lục 3: Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà HA
Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)
Các bước Nguyên liệu Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Pha loãng KN PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 KN kiểm tra, µl 25
T rộn đề u, chuy ển 25 µ l lần lư ợt từ giế ng 1 đến giếng 11
rồi hút bỏ 25 µl 0 HC gà 1 Cho HC gà % (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng KN 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048
Phụ lục 4: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI
Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI)
Các bước Nguyên liệu Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Pha lỗng huyết thanh PBS (µl) 0 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Huyết thanh kiểm tra
50 Chuyển 25 µl từ giếng 1 sang giếng 2, trộn đều, chuyển tiếp tục đến giến g 11 rồi hút bỏ 25 µl 0 Cho kháng nguyên KN 4 HA (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0 Lắc nhẹ, để 30 phút ở nhiệt độ phòng Cho hồng cầu gà Hồng cầu gà 1 % (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng KT 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Mỗi đĩa phản ứng phải có mẫu đối chứng kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn.
Phụ lục 5: Kết quả thu thập mẫu và sàng lọc virus cúm A Tỉnh Giai đoạn 1 1/2015-6/2016 Giai đoạn 2 7/2016-6/2017 Giai đoạn 3 7/2017-3/2018 Tổng P- value Số mẫu (+) Tỷ lệ % Số mẫu (+) Tỷ lệ % Số mẫu (+) Tỷ lệ % Số mẫu (+) Tỷ lệ % Miền Bắc Hà Nội 2688 172 6,40 672 72 10,71 3360 244 7,26a 0,0001 Phú Thọ 2688 100 3,72 672 53 7,89 3360 153 4,55b Thái Nguyên 2688 33 1,23 672 12 1,79 3360 45 1,34 c Tổng 8064 305 3,78 2016 137 6,80 10080 442 4,38C Miền Trung Nghệ An 50 17 34 50 17 34 50 18 36 150 52 34,67a 0,0001 Quảng Nam 1008 94 9,33 1680 122 7,26 672 27 4,02 3360 243 7,23b Quảng Ngãi 1008 143 14,19 1680 111 6,61 672 52 7,74 3360 306 9,11c Huế 1008 86 8,53 1680 47 2,80 672 23 3,42 3360 156 4,64d Kon Tum 1008 227 22,52 1680 466 27,74 672 220 32,74 3360 913 27,17e Tổng 4082 567 13,89 6770 763 11,27 2738 340 12,42 13590 1670 12,29A Miền Nam Đồng Tháp 1008 60 5,95 1680 151 8,99 672 63 9,38 3360 274 8,15a 0,0001 Vĩnh Long 1008 143 14,19 1680 159 9,46 672 57 8,48 3360 359 10,68b Kiên Giang 50 16 32 50 19 38 50 14 28 150 49 32,67c Tổng 2066 219 10,6 3410 329 9,65 1394 134 9,61 6870 682 9,93B Tổng 6148 786 12,78 18244 1307 7,16 6148 611 9,94 30540 2794 9,15
Trong cùng một miền, các giá trị tỷ lệ mang chữ cái a, b, c, d và giữa các miền, các giá trị tỷ lệ mang chữ cái A, B, C