3. Nội dung, nguyên liệu và ph− ơng pháp nghiên cứu
3.3.2.2.Xác định mức độ nhiễm khuẩn đối với thịt
* Ph−ơng pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g thịt
Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa hoặc nuôi cấy láng, đếm khuẩn lạc trên môi tr−ờng thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37oC/24 - 48h. Số l−ợng vi khuẩn hiếu khí trong 1g mẫu đ−ợc tính theo số khuẩn lạc đếm đ−ợc từ các đĩa thạch nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng khác nhau.
Trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp …………47
* Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
+ Theo TCVN 4833 - 1: 2002 [31] (ISO 3100-1 :1991) Thịt và sản phẩm của thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử .
+ Theo TCVN- 5667: 1992 [34], đồng thời có tham khảo của New Zealand, 1991 [70], FAO, 1992 [51].
* Các b−ớc tiến hành
+ Pha loãng mẫu: Cân 25g thịt (bỏ mỡ, gân, bạc nhạc), nghiền tr−ớc trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác chứa 225ml dung dịch pha loãng pepton, đem ly tâm trộn đều ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 3 phút, đ−ợc độ pha loãng ban đầu là 10- 1. Lắc đều mẫu thực phẩm và tiếp tục pha loãng cho tới nồng độ không còn khả năng d−ơng tính, tuỳ theo mẫu sạch hay bẩn mà pha loãng tới 10- 2, 10- 3, ... bằng cách chuyển liên tục 10ml của dung dịch pha loãng tr−ớc vào bình chứa 90ml pepton.
+ Đổ đĩa: Với mỗi mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ liên tiếp, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch và phải dùng que cấy riêng.
Lấy 1ml sản phẩm pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Rót vào từng đĩa khoảng 12 - 15ml thạch đổ đĩa, trộn đều dung dịch mẫu pha loãng và môi tr−ờng thật đồng đều bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. Để đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng nằm ngang.
Tuy nhiên, theo các tài liệu của Newzealand, (1999) dùng kỹ thuật đổ đĩa sẽ làm tổn th−ơng vi khuẩn, nhất là những vi khuẩn trong thịt đ−ợc bảo quản bằng nhiệt độ thấp. Vì thế, chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp cấy láng trên thạch. Các đĩa thạch đã chuẩn bị tr−ớc (rót 12 - 15ml thạch vào hộp lồng, để nguội). Dùng bơm tiêm hút 0,1ml sản phẩm pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa đĩa thạch, dùng que gạt thuỷ tinh láng đều cho tới khi mẫu đ−ợc phân bố đều trên mặt thạch.
+ ủ ấm: úp các đĩa thạch và để tủ ấm ở nhiệt độ 37oC/24 - 48h. Sau 24h tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm khuẩn lạc trên các đĩa thạch. Sau 48h
đọc kết quả chính thức. * Tính kết quả
+ Chọn những đĩa có khuẩn lạc riêng biệt có từ 30-300 vi khuẩn
+ Nếu 2 đậm độ pha loãng kế tiếp nhau cùng số đếm từ 30-300 thì lấy số đếm đ−ợc ở từng đĩa nhân với bội số pha loãng, so sánh tỷ lệ giữa hai giá trị, nếu nhỏ hơn 2 thì lấy số đếm bình quân của hai giá trị. Nếu lớn hơn 2 thì lấy số có giá trị thấp.
+ Nếu các đậm độ pha loãng đều có số đếm trên 300 thì chọn đĩa môi tr−ờng có bội số pha loãng cao nhất.
+ Nếu các đậm độ pha loãng đều có số đếm ít hơn 30 thì chọn đĩa môi tr−ờng có bội số pha loãng cao nhất.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g mẫu đ−ợc tính theo công thức sau:
d* * ) n 1 . 0 n ( C N 2 1+ = ∑
Trong đó: C: số khuẩn lạc đếm đ−ợc trên các đĩa đã chọn
n1, n2: số đĩa ở hai đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1và 2 d: đậm độ pha loãng thấp hơn
N: Số khuẩn lạc trong 1g mẫu kiểm tra. N biểu hiện kết quả d−ới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,0 với 10n (n là số mũ thích hợp của 10).
* Ph−ơng pháp phát hiện và tính số l−ợng E.coli có trong 1g thịt
Tiêu chuẩn này quy định ph−ơng pháp phát hiện và đếm số E.coli trong 1g hoặc 100cm2 thịt và sản phẩm của thịt dùng làm thực phẩm cho ng−ời và gia súc (TCVN 5155 - 1990) [35].
Nguyên tắc: Căn cứ vào đặc tính sinh hoá để xác định vi khuẩn. Pha loãng mẫu thử ở các đậm độ khác nhau ria cấy trên môi tr−ờng chọn lọc để đếm và tính số vi khuẩn.
* Lấy mẫu: Theo TCVN 4833-1:2002 [31] * Cách tiến hành
Trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp …………49
+ Lấy mẫu, đồng nhất và pha loãng mẫu
Cân 100g (bỏ mỡ, gân, bạc nhạc), nghiền tr−ớc trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác vô trùng, bổ sung 90ml dung dịch n−ớc thịt pepton, trộn đều trong máy ly tâm ở tốc độ 1500-2000 vòng/phút trong 2 phút. Sau đó tiếp tục pha loãng tới đậm độ không còn khả năng d−ơng tính 10- 2, 10- 3, 10- 4,...
+ Nuôi cấy, phân lập và giám định: Với mỗi mẫu nuôi cấy ít nhất ở 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch Macconkey. Lấy 0,1ml dung dịch pha loãng ở mỗi đậm độ khác nhau cho vào giữa đĩa thạch. Dùng đũa thủy tinh láng đều trên mặt thạch.
Khuẩn lạc E.coli to, đục, mặt khô, màu đỏ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Căn cứ vào hình dạng, màu sắc khuẩn lạc đếm, chọn 5 khuẩn lạc điển hình giám định tiếp tính chất sinh hoá bằng các phản ứng IMVIC. Nếu là E.coli:
+ Phản ứng Indol: d−ơng tính (I+) làm môi tr−ờng có màu đỏ. Chú ý: E.coli không điển hình (atypic) có phản ứng (-) màu vàng nhạt.
+ Phản ứng đỏ Methyl (Methyl red): cấy vi khuẩn vào môi tr−ờng n−ớc pepton glucose, ủ 37oC từ 2 - 4 ngày, nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl red vào, đọc kết quả. E.coli có phản ứng (+): màu đỏ (âm tính: màu vàng).
+ Phản ứng Voges - proskauer: E.coli có phản ứng âm tính (V-) không màu hoặc màu vàng (d−ơng tính: có màu đỏ).
+ Trên môi tr−ờng thạch Simon - Citrat: Ria cấy vi khuẩn trên mặt môi thạch nghiêng, ủ 37oC từ 1 - 3 ngày. E.coli không sinh tr−ởng phản ứng âm tính (C-).
+ Tính toán kết quả:
Kết quả đ−ợc tính toán theo công thức:
1 1 X = Số khuẩn lạc
Trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp …………50
* Ph−ơng pháp phát hiện và tính số l−ợng Staphylococcus aureus có trong 1g thịt
Theo TCVN 5156 -1990 [36], ngoài ra còn tham khảo ph−ơng pháp của Newzealand 1991 [70]và FAO, 1992[51]và ISO 6579-1993.
* Lấy mẫu: theo TCVN 4833-1:2002 [31] * Cách tiến hành
+ Chuẩn bị mẫu, đồng nhất và pha loãng mẫu
Cân 10g (không mỡ), nghiền nhuyễn trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác, bổ sung thêm 90ml môi tr−ờng BHI (Brain Heart Infusion broth) trộn đều ở tốc độ 1500-2000 vòng/phút trong 2 phút ta thu đ−ợc huyễn dịch có độ pha loãng ban đầu 10- 1. Tiếp tục pha loãng thành các đậm độ 10- 2, 10- 3, 10- 4,... đến khi không còn d−ơng tính.
+ Nuôi cấy, phân lập và giám định tính chất sinh hoá của Sta.aureus
Mỗi mẫu cấy ít nhất ở 3 đậm độ liên tục, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch. Lấy 0,1ml dung dịch pha loãng ở mỗi đậm độ khác nhau cho vào giữa đĩa thạch, dùng que gạt thuỷ tinh láng đều trên mặt thạch. Lật úp đĩa thạch, để tủ ấm 37oC/24h đọc kết quả.
Khuẩn lạc Sta.aureus tròn, lồi, bờ đều, bóng, có vòng trong suốt ở xung quanh, có màu vàng thẫm.
+ Môi tr−ờng thạch Sapman: đây là môi tr−ờng đặc biệt để nuôi cấy và phân lập tụ cầu khuẩn. Thành phần môi tr−ờng gồm:
• Thạch th−ờng: 1000ml
• NaCl : 75g
• Mannit : 10g
• Dung dịch Phenol đỏ 4%: 3 - 4ml
Khi cấy tụ cầu khuẩn vào môi tr−ờng thạch Sapman, nếu là tụ cầu khuẩn gây bệnh sẽ lên men đ−ờng Mannit làm pH thay đổi (pH = 6,8), môi tr−ờng Sapman lúc này trở nên vàng. Nếu tụ cầu khuẩn không gây bệnh sẽ
Trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp …………51
không lên men đ−ờng Mannit, pH = 8,4 môi tr−ờng thạch Sapman có màu đỏ.
+ Giám định lại kết quả bằng cách thực hiện các phép thử kiểm tra đặc tính làm đông huyết t−ơng của vi khuẩn Sta.aureus.
Lấy khuẩn lạc nghi ngờ là Sta.aureus, tăng sinh trong môi tr−ờng BHI để tủ ấm 37oC/24h. Lấy canh trùng cho vào huyết t−ơng thỏ theo tỷ lệ 1 : 4 (0,1ml canh trùng với 0,4 ml huyết t−ơng thỏ) để tủ ấm 37oC trong vòng 4 - 24h đọc kết quả.
+ Tính kết quả: t−ơng tự nh− cách tính số vi khuẩn E.coli có trong 1g thịt.
Bảng 3.1. Đọc kết quả theo bảng Sperber và Tatini
Huyết t−ơng đông cứng sau 4 - 6h khó di động 4+ Xác định là Sta.aureus (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Huyết t−ơng đông chắc sau 6h dễ di động 3+ Không đ−ợc xem là Sta.aureus
Huyết t−ơng đông thành cục nhỏ sau 24h 2+ Không đ−ợc xem là Sta.aureus
Huyết t−ơng đông thành cục nhỏ sau không
liên kết thành khối
1+ Không đ−ợc xem là Sta.aureus
* Kỹ thuật phát hiện Salmonella trong thịt
Đ−ợc áp dụng theo TCVN 5153 - 1990 [33], ngoài ra còn tham khảo ph−ơng pháp của Newzealand, 1991 [70] và FAO, 1992[51] và ISO 6579-1993.
* Lấy mẫu: Theo TCVN 4833-1:2002 [31] * Các b−ớc tiến hành
+ B−ớc 1: chuẩn bị mẫu, đồng nhất mẫu
Cân 25g thịt (bỏ mỡ, gân, bạc nhạc), nghiền nhỏ trong cối sứ, sau đó cho vào bình tam giác chứa 225ml n−ớc đệm pepton BPW 2% (Buffer - Pepton - Water) trộn đều huyễn dịch mẫu, ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 2 phút. Để tủ ấm 37oC/24h.
+ B−ớc 2: tăng sinh
Dùng pipet vô trùng hút 1ml canh trùng trên cho vào ống nghiệm có chứa 10ml môi tr−ờng Muller - Kauffman để vào tủ ấm 42oC. Ngoài ra còn dùng các môi tr−ờng khác để tăng sinh Salmonella nh−: Selenit, Rappaport.
Trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp …………52
+ B−ớc 3: phân lập trên các đĩa thạch chọn lọc
Dùng que cấy vô trùng cấy ria canh trùng từ ống tăng sinh sang 2 đĩa thạch SS và 2 đĩa thạch Green Brilliant (cấy th−a để tạo khuẩn lạc riêng rẽ)
Trên môi tr−ờng SS khuẩn lạc Salmonella có chấm đen ở giữa vì sinh H2S. Trên môi tr−ờng thạch Green Brilliant khuẩn lạc Salmonella có màu hồng (không lên men đ−ờng Lactose và Saccaroza).
+ B−ớc 4: kiểm tra tính chất sinh hoá
Từ khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella, cấy trên môi tr−ờng chọn lọc. Lấy ít nhất 3 khuẩn lạc cho một mẫu, cấy chuyển vào môi tr−ờng kiểm tra KIA theo ph−ơng pháp cấy chích sâu, để tủ ấm 37oC/24h. Kiểm tra những ống KIA có tính chất nh− sau:
K/AG có sinh hơi, sinh H2S hoặc không sinh H2S
K/A không gas, có sinh H2S đ−ợc giữ lại để kiểm tra tiếp
Những mẫu có phản ứng đặc tr−ng của vi khuẩn Salmonella trên môi tr−ờng KIA đ−ợc cấy kiểm tra và Urea, Indol, Lysin Decarboxylase. Tr−ớc khi tiến hành làm phản ứng huyết thanh học với các kháng huyết thanh
Salmonella chuẩn, cũng kiểm tra một số đặc tính sinh vật hoá học: Glucose (+), Lactose (-), Mannitol (-), kiểm tra di động (+), Malonate (-), Dulatol.