- Từ axitlactic tạo thành, tinh chế và có thể ứng dụng vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau.
3.3.Xác ñịnh hoạt lực của α amilaza theo Rukhliadeva [6] Hóa chất và dịch chiết enzyme
CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM
3.3.Xác ñịnh hoạt lực của α amilaza theo Rukhliadeva [6] Hóa chất và dịch chiết enzyme
Hóa chất và dịch chiết enzyme
- Dung dịch HCl 0,1N
- Dung dịch ñệm iot gốc: Hòa tan 0.5 gam iot và 5 gam KI với một lượng nhỏ nước cất trong chén cân có nút mài. Lắc nhẹ hỗn hợp ñể hòa tan hoàn toàn, sau ñó chuyển dung dịch sang bình ñịnh mức 200ml, bổ sung nước cất ñến vạch mức. Bảo quản dung dịch trong bình màu nâu ở chổ tối trong thời gian một tháng.
- Dung dịch iot phân tích: Pha loãng 2ml dung dịch iot gốc với dung dịch HCl 0,1N trong bình ñịnh mức dung tích 100ml. Trước khi sử dụng cần kiểm tra mật ñộ quang của nó trên máy so màu quang ñiện ở bước sóng λ = 453nm với chiều dày cuvet 1cm. Mật ñộ quang của dung dịch phải có giá trị 0,160 ± 0,01. Nếu có sự sai lệch mật ñộ quang phải hiệu chỉnh bằng cách thêm vài giọt acid clohydric hoặc dung dịch iot gốc.
- Dung dịch tinh bột 1%: Hòa tan 1gam tinh bột (theo chất khô tuyệt ñối) với 50 ml nước cất trong bình ñịnh mức 100ml, lắc ñều. Đặt vào bếp cách thủy ñang sôi, lắc liên tục cho tới khi tinh bột tan hoàn toàn. Sau ñó làm nguội bình và bổ sung 10ml dung dịch ñệm axetat pH = 4,7 (hoặc 10 ml dung dịch ñệm phosphate pH = 4,9) bổ sung nước cất tới vạch mức, lắc ñều. Dung dịch ñược chuẩn bị trong ngày sử dụng.
- Dịch chiết enzyme phân tích: Chuẩn bị dịch chiết enzyme phân tíchtừ dịch chiết enzyme gốc bằng cách pha loãng sao cho trong 3 ml dịch chế phẩm enzyme phân tích có chứa một lượng enzyme ñủ ñể thủy phân tinh bột từ 20% tới 70% trong ñiều kiện xác ñịnh. Do ñó tùy thuộc vào hoạt ñộ của chế phẩm enzyme gốc mà tiến hành pha loãng theo tỷ lệ thích hợp.
dung dịch tinh bột 1%, ñặt vào máy ñiều nhiệt có nhiệt ñộ 30 C trong thời gian 10 phút ñể ñưa nhiệt ñộ của dung dịch ñến 30oC. Bổ sung vào ống nghiệm thứ nhất 5 ml nước cất (ống kiểm chứng), vào ống nghiệm thứ hai 5ml dung dịch enzyme phân tích (ống thí nghiệm), khuấy ñều nhanh hỗn hợp và giữ nguyên ở nhiệt ñộ này trong thời gian 10 phút. Lấy từ 2 ống nghiệm trên mỗi ống 0,5ml hỗn hợp phản ứng cho vào hai ống nghiệm khác ñã có sẵn 50 ml dung dịch iot phân tích, lắc ñều hỗn hợp trong bình. Các dung dịch nhận ñược có màu như sau:
+ Dung dịch kiểm chứng có màu xanh
+ Dung dịch thí nghiệm có màu tím với cường ñộ màu khác nhau tùy thuộc vào lượng tinh bột chưa bị thủy phân.
- Đo cường ñộ màu của các dung dịch ở bước sóng λ = 656nm so với nước cất.
Kết quả
Lượng tinh bột ñược thủy phân (C) ñược tính theo công thức:
1, , 0 * 1 2 1 D D D C − =
Trong ñó: D1 là mật ñộ quang ño ñược của dung dịch kiểm chứng D2 là mật ñộ quang ño ñược của dung dịch thí nghiệm 0,1 là lượng tinh bột ñem phân tích, gam.
3.4. Xác ñịnh hoạt lực của γ-amilaza theo phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina [6]. V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina [6].
Hóa chất và enzyme sử dụng:
- Dung dịch Fehling I: hòa tan 34,64g CuSO4.5H2O trong 500ml nước cất. - Dung dịch Fehling II: hòa tan 173g kali natri tatrat kép và 50g NaOH trong 500ml nước cất.
- Dung dịch H2SO4 25% - Dung dịch KI 30%
- Dung dịch tinh bột 1%
Tiến hành:
- Mẫu thí nghiệm: Hút 1ml dung dịch tinh bột 1% cho vào bình tam giác 50ml, bổ sung 1,5ml nước cất và 0,5ml dịch chiết enzyme (các dung dịch này ñã ñược ñưa về nhiệt ñộ 30oC), lắc ñều và ñưa vào máy ñiều nhiệt và giữ chính xác 10 phút. Đình chỉ phản ứng bằng 1ml Fehling I và 1 ml Fehling II. Đun sôi 2 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi ñầu tiên), làm nguội và bổ sung 1 ml H2SO4 25% ñể hòa tan Cu2O, sau ñó bổ sung 2ml KI 30% rồi chuẩn ñộ bằng dung dịch thiosulfit natri 0,1N.
+ Lưu ý hoạt ñộ dịch chiết enzyme quá thấp (không có lớp Cu2O màu ñỏ ở ñáy bình phải tăng lượng enzyme, ngược lại nếu chỉ có Cu2O mà không có màu xanh của dung dịch Fehling ở trên phải pha loãng dịch chiết enzyme.
- Mẫu kiểm chứng: Tiến hành như ñối với mẫu thí nghiệm, nhưng thay thế 0,5 ml dịch chiết enzyme bằng 0,5ml dịch chiết enzyme ñã bị vô hoạt bằng cách ñun sôi.
Kết quả:
Hoạt ñộ của enzyme γ-amilaza (HdG) tính bằng ñv/gam ñược xác ñịnh theo công thức: 1 , 0 10 60 3 , 3 × × × × × = m f a HdG Trong ñó:
a: Hiệu số ml Na2S2O3 0,1N của mẫu kiểm chứng và thí nghiệm k: Hệ số hiệu chỉnh nồng ñộ Na2S2O3 0,1N
3,3: Hệ số chuyển ñổi thành glucoza 10: Thời gian thủy phân cơ chất, phút. m: Lượng enzyme sử dụng, gam 60: hệ số chuyển thành giờ
Để kết tủa các oxy axit và oxy phenol cho vào bình ñịnh mức 50 ml Dịch thử 10 ml
Chì axetat bazic 10 ml
Lắc ñều, cho thêm nước cất vừa ñủ 50ml. Lắc ñều. Giữ 1 giờ ở nhiệt ñộ +1oC ñến 4oC ñể cho chì malat kết tủa hết. Lọc.
Lấy 1ml dịch lọc, cho vào bình ñịnh mức 100ml với một ít nước cất, và H2SO4 10% ñể loại chì thừa (khoảng 10 ml). Thêm nước cất vừa ñủ 100 ml. Ly tâm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho vào 2 ống nghiệm:
Hóa chất Ống 1 Ống 2
Dịch lọc 0,5 ml 0,5 ml CuSO4 4% 0,03 ml 0,03 ml H2SO4 ñậm ñặc 3,0 ml 3,0 ml
Lắc ñều, ñể vào nồi cách thủy sôi 5 phút ñể oxy hóa axit lactic thành acetaldehyt. Làm nguội về nhiệt ñộ thường dưới vòi nước lạnh.
Cho tiếp vào ống số 1, dung dịch para oxydiphenyl 0,05 ml. Để yên 30 phút ở nhiệt ñộ thường, sau ñó cho vào nồi cách thủy sôi 90 giây ñể hòa tan thuốc thử thừa. Làm nguội dưới vòi nước lạnh.
Đọc ñộ tắc quang học ở quang sắc kế với bước sóng 575 nm
Tính kết quả
Độ hấp thụ (X) của acetaldehyd (do axit lactic bị oxy hóa thành) kết hợp với para oxydiphenyl:
X = A – B Trong ñó: Trong ñó:
A: Độ hấp thụ của ống số 1 có para oxydiphenyl. B: Độ hấp thụ của ống số 2.
mẫu thử.
Xây dựng biểu ñồ chuẩn
Pha dung dịch chuẩn liti lactat (D1: 1 ml tương ñương 1mg acid lactic): Liti lactat: 106,5mg
H2SO4 1N: 20 ml Nước cất vừa ñủ: 100 ml
Hòa tan liti lactat trong 50 ml nước cất. Cho thêm 20 ml H2SO4 1N, và thêm nước cất vừa ñủ 100 ml.
Pha dung dịch chuẩn liti lactat (D2: 1 ml tương ñương với 10 µg axit lactic): Pha loảng D1 ra 100 lần bằng cách lấy 1 ml D1 hòa vào nước cất vừa ñủ 100 ml.
Xây dựng biểu ñồ chuẩn:
Lấy 5 ống nghiệm và rót vào các loại dung dịch sau (bảng):
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Dung dịch D2, ml Nước cất, ml CuSO4 4%, ml H2SO4 ñậm ñặc, ml 0,1 0,4 0,03 3 0,2 0,3 0,03 3 0,3 0,2 0,03 3 0,4 0,1 0,03 3 0,5 0 0,03 3
Lắc ñều từng ống nghiệm, ñun sôi 5 phút trong nồi cách thủy ñể oxy hóa acid lactic thành acetaldehyd và làm nguội về nhiệt ñộ thường bằng vòi nước lạnh.
Cho tiếp vào mỗi ống 0,05 ml para oxydiphenyl. Để yên 30 phút và ñun tiếp 90 giây ở nồi cất thủy. Làm nguội dưới vòi nước lạnh.
Đo mật ñộ quang với bước sóng 575 nm và vẽ biểu ñồ mật ñộ quang của 5 ống nghiệm chứa lần lượt 1 ñến 5 µg axitlactic.
ống mẫu chứa 20 g axit lactic trong 1000 ml. Ví dụ C là mật ñộ quang của ống này: Hàm lượng axit lactic theo phần trăm (X) tính theo công thức:
*20 ) ( ) ( B C B A X − − = (g/l)
3.6. Xác ñịnh hàm lượng ñường khử bằng phương pháp so màu sử dụng axit dinitro salicylic (DNS) [6].