Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3.Phương pháp vi sinh vật
2.2.3.1. Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn
Môi trường ñể nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus casei là môi trường MRS agar của Merck, Đức. Đây là môi trường có pha chế sẵn và có thành phần như sau: [14], [29].
Bảng 2.2. Thành phần môi trường MRS Agar
Thành phần Gam/lít Peptone 10,0 Cao thịt 8,0 Cao nấm men 4,0 Glucose 20,0 K2HPO4 2,0 CH3COONa.3H2O 5,0 Triamonium citrate 2,0 MgSO4.7H2O 0,2 MnSO4.4H2O 0,05 Agar 10,0 Sorbitan mono-oleate (C24H44O6) 1ml pH = 6,2 ±0,2
Chủng vi khuẩn lactobacillus casei ở dạng ñông khô, hoạt hóa ở môi trường trên theo các bước sau:
- Dùng que cấy lấy một lượng vừa phải chủng ñông khô cho vào lọ ñựng 10ml nước muối sinh lý ñã qua hấp tiệt trùng, khuấy tan ñều.
- Chuẩn bị môi trường MRS ñã hấp tiệt trùng, ñổ ñều trên 5 ñĩa petri, làm nguội. - Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch khuẩn trên cho vào ñĩa petri, sau ñó dùng que trang trang ñều trên bề mặt thạch.
- Nuôi cấy trong thời gian 48h, ổn ñịnh ở nhiệt ñộ 30oC trong tủ bảo ôn.
2.2.3.2. Phương pháp xác ñịnh gián tiếp số lượng tế bào bằng cách ñếm các khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch [5]
Nguyên tắc: Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho ñến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy ñược. Đây là cơ sở của việc ñịnh lượng tế bào trên ñĩa thạch, bởi số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất ñịnh chỉ số lượng tế bào sống có trong thể tích giống ñó. Thông thường, tất cả các tế bào ở phase tăng trưởng hay ở phase ổn ñịnh ñều có khả năng hình thành khuẩn lạc. Vì vậy, số lượng khuẩn lạc ñếm ñược gần như tương ñương với số lượng tế bào sống.
Để ñịnh lượng chính xác, cần phải thực hiện sao cho mỗi một khuẩn lạc chỉ ñược hình thành từ một tế bào. Do dịch tế bào sử dụng trong phòng thí nghiệm thường có nồng ñộ cao, thường nhiều hơn 106 tế bào/ml, nên cần thiết phải ñược pha loãng trước khi cấy. Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng ñể giảm nồng ñộ tế bào từ 10 ñến 100 lần cho ñến khi ñạt vài nghìn tế bào/ml.
Cách tiến hành ñược thể hiện ở phụ lục 3.8.
2.2.3.3. Phương pháp chuyển giống sang môi trường lên men
Giống phải ñược hoạt hóa trước khi lên men ñể ổn ñịnh trạng thái sinh lý, tiến hành nhân giống theo các cấp, thể tích cấp sau lớn hơn cấp trước khoảng 10 lần [1], [10]. Trong lên men công nghiệp việc rút ngắn thời gian lên men là cần thiết, do ñó môi trường nhân giống ñược thiết kế có thành phần giống môi trường lên men nhằm tạo ñiều kiện thích nghi cho chủng nghiên cứu và giảm thời gian lên men.
Mật ñộ giống cấy phải ñược xác ñịnh trước khi thực hiện việc lên men thông qua phương pháp xác ñịnh gián tiếp mật ñộ tế tào bằng cách ño OD620nm [39].
Trong qúa trình nhân giống và lên men phải theo dõi tính thuần khiết của giống cấy, tránh tình trạng bị tạp nhiễm vi sinh vật lạ gây ảnh hưởng ñến hiệu suất lên men và làm sai lệch kết quả khảo sát.