CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát ñặc ñiểm của các nguyên liệu trong nghiên cứu
3.3.1.Khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactobacillus case
Dựa vào nguyên tắc ñã trình bày ở mục 2.2.3.2. và phụ lục 3.8, chúng tôi tiến hành thực nghiệm như sau:
- Cho 100ml dịch ñường có nồng ñộ 5% vào bình tam giác có dung tích 250ml - Bổ sung thành phần môi trường lên men vào dịch ñường trên như ñã trình bày ở mục 2.2.2.3.
- Hấp thanh trùng môi trường ở nhiệt ñộ 121oC trong thời gian 20 phút. - Làm nguội môi trường và tiến hành cấy vi khuẩn lactibacillus casei trong ñiều kiện vô trùng.
- Nuôi ở nhiệt ñộ 37oC trong 24 giờ.
- Pha loãng môi trường trên trong nước cất ñã hấp vô trùng bằng cách sử dụng 7 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất vô khuẩn và một số ống hút 1ml ñã hấp tiệt khuẩn. Mức ñộ pha loãng khác nhau như sau:
+ Hút 1ml mẫu dịch vi khuẩn trên cho vào ống nghiệm thứ nhất chứa 9ml nước cất, khuấy ñều. Ta có mức ñộ pha loãng lúc này là 10-1 lần
+ Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml nước cất vô khuẩn. Trộn ñều và ta ñược ñộ pha loãng là 10-2
+ Tiếp tục chúng tôi làm tương tự và có các mức ñộ pha loãng khác nhau như sau: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
Ở mỗi ñộ pha loãng phải khuấy ñều và lắc kỹ. Tương ứng với mỗi ñộ pha loãng, tiến hành gieo cấy vào hộp petri theo trình tự như sau:
+ Dùng hộp petri ñã vô khuẩn chưa có môi trường. Chuẩn bị môi trường MRS như ñã trình bày ở mục 2.2.3.1, hấp thanh trùng ở nhiệt ñộ 121oC trong thời gian 20 phút, ñể nguội ñến 50 -55oC.
+ Dùng pipet vô khuẩn hút 1 ml canh trường trên, hé mở hộp petri rồi cho vào, ñậy nắp lại ñồng thời xoay nhẹ hộp trên bàn phẳng ñể chúng dàn trải ñều ở ñáy hộp. + Hé mở nắp hộp, nhanh tay ñổ thạch vào, ñậy nắp và xoay nhẹ hộp trên bàn cho thạch và vật gieo cấy ñược trộn ñều, dàn thành một lớp trên ñáy hộp.
+ Để thạch ñặc lại, lật ngược hộp petri, dán nhãn lên các hộp tương ứng với từng ñộ pha loãng, gói giấy báo và ñặt vào tủ ấm có nhiệt ñộ 30oC, cứ mỗi ñộ pha loãng chuẩn bị 3 hộp petri. Thao tác phải thật nhanh và ñược thực hiện trong môi trường vô trùng.
Sau 2 ngày, lấy các hộp ra quan sát nếu thấy trên bề mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc, bề mặt khô, nhẵn bóng, có màu trắng sữa thì ñó là dấu hiệu của những khuẩn lạc vi khuẩn. Mỗi khuẩn lạc là tập hợp tế bào ñược phát triển từ một tế bào ñơn. Đếm và xác ñịnh số lượng khuẩn lạc ở mỗi mức ñộ pha loãng khác nhau. Kết quả ñược tính theo phụ lục 3.8.
Ở mức ñộ pha loãng10-3 lần trên 3 ñĩa petri theo thứ tự từng ñĩa là: 48, 53 và 52, khi ñó:
N = (48 + 53+ 52)/3 = 51 D = 1/10-3 = 103 D = 1/10-3 = 103
Suy ra số tế bào/ ml mẫu = 103 1 51
× = 51.103
tế bào/ml
Các khuẩn lạc Lactobacillus casei ở các mức pha loãng 10-3 ñược thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Các khuẩn lạc Lactobacillus casei ở các mức pha loãng 10-3
Đồng thời với việc hút và cấy canh trường vào môi trường MRS. Chúng tôi tiến hành ño OD ở bước sóng 620nm của từng mật ñộ pha loãng khác nhau.
Kết quả của việc ño OD tương ứng với số lượng khuẩn lạc ñếm ñược ở mỗi mức ñộ pha loãng khác nhau, chúng tôi xác ñịnh ñược số lượng khuẩn lạc ở mỗi OD ñể thuận lợi cho các lần lên men sau này.
Hình 3.7. Đường cong biểu diễn mật ñộ tế bào ở các mức pha loãng khác nhau
Từ ñường cong trên, chúng tôi suy luận ñược lượng khuẩn lạc có trong dịch khuẩn chuẩn bị ñể cân ñối lượng vi khuẩn cho từng mẽ lên men trong nghiên cứu. Ở ñây chúng tôi thấy ở bước sóng 620nm thì OD = 0,173, tương ứng với mức ñộ pha loãng 10-3 lần, số lượng vi khuẩn ñếm ñược là 51.103 tế bào/ml.