Phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Là phƣơng pháp phân loại dựa trên giải trình tự gien ADNr 16S. Xác định trình tự ADNr 16S của các chủng vi khuẩn theo phƣơng pháp của Sakiyama và cs năm 2009 [106].

* Tách chiết ADN

- Nguyên tắc: Thành tế bào của VSV đƣợc phá vỡ bởi lyzozim và các chất tẩy mạnh nhƣ SDS - Tris - HCl giúp ADN đƣợc giải phóng. Protein và ARN đƣợc tách ra khỏi ADN nhờ các enzym xúc tác RNazaA, proteaza K và các dung môi Chlorofom: isoamyl alcohol (24:1). Cuối cùng ADN đƣợc tủa bằng etanol (-220C) tuyệt đối và xác định nồng độ ADN trong dịch mẫu.

- Tiến hành: ADN đƣợc chiết xuất và tách từ sinh khối ƣớt + Ly tâm 1.5 ml dịch nuôi vi khuẩn để lấy sinh khối tế bào.

+ Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE ( đệm TE: 15 mM Tris-HCl +1 mM EDTA pH 7,5).

+ Thêm 0,4 mg lyzozim. Trộn đều, ủ 370C/1 giờ. Trộn đều 3 phút.

+ Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 370C/30 phút. + Thêm một thể tích tƣơng đƣơng phenol: clorofom: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 13000 v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

+ Thêm 8 l ARNaza 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút. + Thêm 12 l proteinaza K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 560C.

+ Thêm một thể tích tƣơng đƣơng phenol: clorofom: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 13000 v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

63

+ Thêm 1 thể tích tƣơng đƣơng clorofom: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 13000 v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

+ Thêm 1/ 10 thể tích natri axetat 3M và 1ml etanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút. Ly tâm 13000 v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên.

+ Rửa tủa bằng etanol 70%.

+ Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không. + Hoà tan ADN trong 50-100 l nƣớc hoặc TE.

* Phản ứng khuếch đại ADN (PCR)

- Nguyên tắc: Phƣơng pháp này sử dụng ADN polymeraza và các oligonucleotit

tổng hợp nhân tạo, một đoạn ADN dùng làm khuôn đƣợc nhân lên nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỷ lần mà không cần đến nhiều tế bào vi khuẩn.

- Tiến hành: + Thành phần phản ứng: Thành phần Thể tích (l) Đệm 10X 10 MgCl2 8 dNTP 2,0 mM 10

Mồi xuôi (10 pmol/l) 2 Mồi ngƣợc (10 pmol/l) 2 Taq polymeraza 2 Template ( khuôn) 1-2 H2O cho đủ 100 + Chu trình nhiệt: 960C - 3 phút 960C - 45giây 550C - 30 giây 35 chu kỳ 720C - 2 phút 720C - 7 phút 40C - 

64

+ Primer cặp mồi:

Mồi xuôi : 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. Mồi ngƣợc: 1525R 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2 ml, nƣớc cất: 98 ml, agaroza: 1 g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300 ml dung dịch 1 X TAE, trộn 2 l dung dịch 6X với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng, chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.

* Tinh sạch sản phẩm PCR

- Sử dụng bộ kit QIA gien theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

+ Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều. + Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút. + Đổ bỏ dịch phía dƣới cột.

+ Bổ sung 750 l dung dịch đệm PE lên cột. Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút + Đổ bỏ dịch dƣới cột.

+ Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút. + Chuyển cột sang ống Eppendoft mới.

+ Thêm 30 l nƣớc. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. + Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút.

+ Lấy dịch phía dƣới.

- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu: Kiểm tra độ hấp phụ trên máy quang phổ ở các bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. AND sạch khi tỷ lệ A260/A280 > 1,7.

* Phản ứng khuếch đại cho chuỗi trình tự ADN

- Hòa hợp phản ứng của các gien kết thúc có sẵn (Termix): Dung dịch đệm 5X 9 l

Trộn lẫn phản ứng có sẵn Bigdye 18 l H2O 9 l

65 - Thành phần phản ứng PCR cho chuỗi: Termix 8 l Cặp mồi (*) 1 l Khuôn 1 l ( nồng độ ADN là 40-60 g/ml) H2O 10 l (*) Các loại mồi đã sử dụng: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'. 780F: 5'- GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'- CTGCTGCCTCCCGTAG-3'. 1100F: 5'- GCAACGAGCGCAACCC-3'. 920R: 5'- GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'. - Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gien:

960C - 1 phút 960C - 10 giây

500C - 5 giây 25 chu kỳ 600C - 4 phút

* Tinh sạch sản phẩm PCR cho xác định trình tự

- Chuyển 20 l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch

- Thêm 5 l EDTA 125 mM và 60l etanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm 13.000 v/p, 15phút

- Bỏ dịch, thêm 60 l etanol 70% để rửa, ly tâm 15000 v/p, 10 phút - Làm khô.

- Thêm 10 l HiDi formamit - Để ở 960C trong 2 phút.

- Cho ngay mẫu vào nƣớc đá lạnh.

- Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho xác định trình tự. - Vận hành máy xác định trình tự gien ABI 3100 Avant.

66

* Đọc trình tự ADN và xây dựng cây phân loại

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động (ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer-Mỹ). Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý trên phần mềm Clustal X. Các trình tự đƣợc so sánh với trình tự ADNr 16S của các loài đã đƣợc công bố từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Xây dựng cây phát sinh chủng loại, phân tích Bootstrap đƣợc thực hiện từ 1000 lần lặp lại ngẫu nhiên. Tên loài vi sinh vật đƣợc xác định với xác suất tƣơng đồng cao nhất.