1.2.2.1. Cấu trúc của tinh bột
Trong tự nhiên, tinh bột tồn tại dƣới dạng các hạt có kích thƣớc 0,002- 0,12 mm phụ thuộc vào nguồn gốc tinh bột. Ngoài cùng của hạt tinh bột là lớp vỏ xenluloza chứa ít nƣớc nên bền với tác động bên ngoài, bên trong là lớp tinh bột. Với cấu trúc này tinh bột ít chịu ảnh hƣởng của axit hoặc enzym. Khi phá vỡ cấu trúc này bằng nhiệt thì các hạt tinh bột hấp thụ nƣớc, phồng lên, dính vào nhau làm độ nhớt tăng và gây hiện tƣợng hồ hoá. Nếu xử lý nhiệt lâu hơn, hạt tinh bột sẽ bị phân cắt do tác dụng thuỷ phân từng phần và hoà tan một phần các phân tử cấu thành tinh bột, độ nhớt của dung dịch giảm xuống.
Hình 1.5. Cấu trúc của
tinh bột Hình 1.6. Cấu trúc mạch amyloza Hình 1.7. Cấu trúc mạch amylopectin Đại phân tử tinh bột đƣợc tạo thành từ nhiều lớp đồng tâm: lớp ngoài là amylopectin, lớp trong là amyloza. Hai thành phần amyloza và amylopectin có tỷ lệ
40
đặc thù, thay đổi tùy theo từng loại tinh bột, amyloza thƣờng chiếm tỷ lệ 13- 37% còn amylopectin chiếm 63-87% [theo 7, 16].
Amyloza có cấu tạo dạng chuỗi không phân nhánh gồm khoảng 300-1000 gốc glucoza kết hợp với nhau qua liên kết -1,4 glycozit dài xoắn theo kiểu lò xo. Amyloza đƣợc kết tinh bằng rƣợu butylic. Amyloza không tan trong nƣớc lạnh mà dễ tan trong nƣớc ấm, tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao và không bền khi nhiệt độ hạ thấp [theo 7, 16].
Các dung dịch đậm đặc của amyloza nhanh chóng tạo nên dạng gel vô định hình, cứng, rắn hoặc co giãn, sau đó tạo thành tinh thể và kết tủa không thuận nghịch. Amyloza có xu hƣớng kết tinh vì nó có cấu tạo đơn giản, không cồng kềnh về mặt lập thể, tốc độ phân huỷ phụ thuộc vào pH, nồng độ, khối lƣợng phân tử và sự có mặt của các ion [59, 60, 81, 82].
Amylopectin có khối lƣợng phân tử 500.000-1.000.000 kDa, đƣợc cấu tạo bởi các gốc glucoza liên kết với nhau bằng cả kiên kết -1,4 glycozit và -1,6 glycozit. Một số nghiên cứu cho thấy trong phân tử cũng có cả liên kết -1,3 glycozit. Cấu trúc phân tử của nó bao gồm một mạch nhánh trung tâm (chứa liên kết
-1,4 glycozit) từ đó phát ra các nhánh phụ có chiều dài vài chục gốc glucoza. Điểm phân nhánh có liên kết -1,6 glycozit. Vì nó có cấu trúc mạch nhánh nên phân tử không tạo thành dạng xoắn ốc nhƣ amyloza [theo 7, 16].
Khi phản ứng với iot, amylopectin cho màu đỏ nâu (do kết quả của sự hình thành nên các hợp chất hấp phụ). Dung dịch amylopectin không có xu hƣớng kết tinh nên có khả năng giữ nƣớc. Khác với dung dịch amyloza, amylopetin có độ nhớt cao và bền hơn. Cả hai thành phần này đều đƣợc cấu tạo từ các đơn vị -D-glucoza qua liên kết 1-4 và 1-6 glycozit. Tinh bột không hoà tan trong nƣớc lạnh nhƣng bị hồ hoá khi đun nóng đến 60-80oC. Dƣới tác dụng của enzym amylaza hoặc axit mạnh, các liên kết glycozit bị phá huỷ để tạo thành phân tử thấp hơn. Sự thuỷ phân xảy ra ở hai mức độ là dịch hoá và đƣờng hoá. Sản phẩm chủ yếu của dịch hoá tinh bột là các polyglucoza tƣơng ứng (dextrin), còn sản phẩm của đƣờng hoá là glucoza hoặc maltoza [15, 41].
41
1.2.2.2. Enzym thuỷ phân tinh bột
Amylaza rất phổ biến ở vi sinh vật, thuộc nhóm enzym xúc tác cho sự phân giải liên kết nội phân tử trong polysacarit với sự tham gia của nƣớc. Cơ chất của amylaza là tinh bột và glycogen, theo tính chất và cách tác dụng lên tinh bột, phân biệt amylaza thành các loại: -amylaza, -amylaza, glucoamylaza và oligo 1-6 glucozidaza [37, 89, 114].
* -Amylaza (-1,4 glucan-glucanhydrolaza )
-amylaza từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm giống nhau. Phân tử lƣợng của các -amylaza từ các nguồn khác nhau xấp xỉ 40.000 kDa. -amylaza có khả năng phân cắt các liên kết -1,4 glycozit nằm phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên không tuân theo trình tự nào. Liên kết -1,6 glycozit không bị thuỷ phân sẽ phong toả các liên kết -1,4 gần nó, làm cho -amylaza không đƣợc tác dụng, vì thế với amylopectin thì sản phẩm tạo ra là các dextrin chứa cả liên kết - 1,4 và -1,6 glycozit.
Khi tác dụng lên tinh bột, enzym này giải phóng glucoza ở dạng - amutanmer nên đƣợc gọi là -amylaza. -amylaza có khả năng thuỷ phân tinh bột và thuỷ phân bột thô. Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm nhiều giai đoạn khác nhau. Thông thƣờng thì -amylaza chỉ thuỷ phân tinh bột thành các phân tử dextrin có khối lƣợng phân tử thấp (không cho màu xanh với iot) và một ít maltoza. -amylaza dễ tan trong nƣớc, trong các dung dịch muối và rƣợu loãng. Các protein -amylaza có tính chất axit béo và tính chất của globulin, điểm đẳng điện nằm trong phạm vi vùng 4,2- 5,7 [theo 7, 16, 96].
-amylaza là một metalo enzym trong phân tử có chứa ion canxi, khi tách hoàn toàn Ca2+ ra khỏi phân tử thì enzym bị mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất vì Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc III và duy trì cấu hình của enzym. -amylaza bền nhiệt hơn so với các amylaza khác, tất cả các - amylaza đều bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng nhƣ Cu2+, Hg2+, Ag2+... Một loạt các ion kim loại nhƣ Li+, Na+, Mg2+, Cr3+, Mn2+, Co2+, Sn2+, Cd2+ không có ảnh hƣởng đến -
42
amylaza, điều kiện hoạt động của -amylaza từ các nguồn khác nhau thƣờng không giống nhau [Theo 7, 51, 59, 60, 73, 82].
Những khác biệt về tính chất (nhiệt độ, pH tối thích, mức độ thuỷ phân và đặc tính thuỷ phân) của -amylaza từ các nguồn khác nhau đã mở ra triển vọng to lớn cho việc ứng dụng chúng một cách thích hợp và hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất [15, 21, 37, 41].
* -Amylaza (-1,4 Glucan maltohydrolaza)
-Amylaza xúc tác thuỷ phân liên kết 1-4 glycozit trong tinh bột, glycogen và polysacarit đồng loại, phân cắt tuần tự gốc glucoza từ đầu không khử của mạch.
-amylaza hầu nhƣ không thuỷ phân hạt tinh bột nguyên vẹn mà thuỷ phân mạnh mẽ hồ tinh bột. -amylaza phân giải 100% amyloza thành matoza và phân giải 54- 55% amylopectin thành matoza. Matoza tạo thành có cấu hình , vì thế enzym tƣơng ứng đƣợc gọi là -amylaza. -Amylaza có trung tâm xúc tác chứa các nhóm - SH và COOH cùng với đƣờng imidazol của gốc histidin [Theo 7, 16, 55].
-Amylaza hoạt động tối thích ở pH 4,6 và nhiệt độ 10-50oC, bị bất hoạt ở 70oC. Khác với -amylaza, nó liên kết rất bền khi không có mặt Ca2+. -amylaza bị kìm hãm hoàn toàn bởi Cu2+, Hg+, iot, ozon… [Theo 7, 82, 91].
Hình 1.8. Mô hình cấu trúc phân tử bậc II của -amylaza
Hình 1.9. Mô hình cấu trúc phân tử bậc IIcủa -amylaza
* Glucoamylaza (-1,4 D-glucan-glucanohydrolaza)
Glucoamylaza là một exoenzym, thuỷ phân liên kết 1-4 glycozit trong phân tử polysacarit, tách tuần tự từng gốc glucoza khởi đầu không khử của mạch. Nó cũng thuỷ phân liên kết -1,6 glucozit và -1,3, chịu ảnh hƣởng của kích cỡ cấu
43
trúc phân tử và các liên kết kế bên. Tại các điểm phân nhánh thì tốc độ thuỷ phân chậm hơn glucoamylaza có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, amylopectin, dextrin, izomanoza và mantoza tới glucoza. Đa số glucoamylaza thuộc loại enzym "axit" thể hiện hoạt độ tối đa ở pH 3,5-5,5. So với -amylaza thì glucoamylaza bền với axit hơn nhƣng kém bền với tác dụng của rƣợu etylic, axit axetic và không đƣợc bảo vệ bằng Ca2+ [55, 82, 91, 109].
* Oligo-1,6 glucozidaza (dextrinaza tới hạn)
Enzym này thuỷ phân các liên kết -1-6 glycozit trong izomantoza, các dextrin tới hạn và có khả năng chuyển hoá chất này tới đƣờng lên men đƣợc. Nó thuỷ phân dextrin mạnh hơn so với và -amylaza [Theo 7, 16, 55].
1.2.2.3. Vi sinh vật tổng hợp enzym thuỷ phân tinh bột
Vi sinh vật là nguồn sinh amylaza rất lớn. -amylaza đƣợc thấy ở hầu hết các loại VSV nhƣ nấm sợi, nấm men giả, vi khuẩn có bào tử và xạ khuẩn. Ở vi khuẩn, amylaza chủ yếu đƣợc sinh ra từ các loài thuộc chi Clostridium, Bacillus nhƣ B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. caldovelox [59, 60, 73, 91, 96], B. licheniformis
[51, 53, 82, 114], Bifidobacterium [75]…
Amylaza của vi khuẩn khác với nấm sợi ở chỗ ít có khả năng đƣờng hoá nhƣng lại dịch hoá hồ tinh bột rất mạnh, tạo thành những -dextrin phân tử lƣợng cao bắt màu với iot. -amylaza của vi khuẩn giống với của nấm men ở chỗ là chúng đƣợc ổn định bằng ion canxi. Do có khả năng chịu nhiệt cao và có phổ pH rộng (từ chịu axit đến chịu kiềm) nên -amylaza của vi khuẩn đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây. Số lƣợng gien mã hoá -amylaza của vi khuẩn đã đƣợc tách dòng cũng chiếm tỷ lệ cao trong ngân hàng dữ liệu gien [55].
Hiện nay, có nhiều công trình nghiên cứu về tính chịu nhiệt của -amylaza từ vi khuẩn [12, 21, 37, 41, 53, 73, 114], các tác giả này đã phân lập đƣợc các chủng vi khuẩn sinh -amylaza chịu nhiệt cao, xác định đƣợc ảnh hƣởng của tỉ lệ C: N lên hoạt tính của enzym và ion Ca2+, Mg2+ làm ổn định -amylaza ở nhiệt độ cao. Hoạt tính amylaza có nhiệt độ tối ƣu ở 75- 85oC, pH tối ƣu là 6,5- 7,5.
44
Các muối amoni của axit vô cơ (NH4H2PO4, (NH4)2SO4, NH4Cl) cho hiệu quả sinh tổng hợp -amylaza thấp. Ngƣợc lại, các axit amin thƣờng cho hiệu quả tổng hợp -amylaza cao, vì vậy ngƣời ta hay bổ sung các dịch thuỷ phân protein vào môi trƣờng nuôi vi sinh vật.
Chế phẩm -amylaza từ vi sinh vật đã đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp và đƣợc sản xuất với lƣợng lớn. Chế phẩm glucoamylaza tách từ VSV có nhiều triển vọng ứng dụng trong sản xuất bia, rƣợu, maltoza và glucoza. Vi sinh vật sinh tổng hợp amylaza đƣợc ứng dụng nhiều trong xử lý rác thải, chất thải nông nghiệp, nƣớc thải giàu tinh bột từ các làng nghề chế biến [Theo 7, 12, 16].
1.2.3. Vi sinh vật phân giải protein
Protein là các polyme phân tử lớn, chủ yếu bao gồm các L. axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit, khối lƣợng phân tử của protein từ hàng trăm đến hàng triệu dalton [Theo 2, 119].
1.2.3.1. Enzym proteaza
* Giới thiệu chung
Proteaza đƣợc phân bố rất rộng rãi ở nhiều đối tƣợng. So với proteaza động vật và thực vật, proteaza vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trƣớc hết, hệ proteaza vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp, bao gồm nhiều enzym rất giống nhau về cấu trúc, khối lƣợng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dƣới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzym khác nhau nên proteaza vi sinh vật thƣờng có tính đặc hiệu rộng rãi, cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Một loại vi sinh vật có thể tạo ra nhiều loại proteaza khác nhau. Ngƣời ta đã tách chiết nhiều loại proteaza khác nhau từ vi sinh vật mà chủ yếu là từ vi khuẩn và nấm mốc [2, 19, 20, 29, 120, 122].
Nhóm enzym proteaza (peptit- hydrolaza 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein hoặc polypeptit, tao các sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều proteaza cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin [120, 122].
45
* Phân loại proteaza
- Dựa vào tính tác động đặc hiệu, ngƣời ta chia proteaza thành 2 loại [2, 16]:
+ Proteaza (hay enđopeptidaza): Thuỷ phân protein thành các đoạn peptit (pepton, oligopeptit). Chúng có tính đặc hiệu tƣơng đối rộng.
+ Peptidaza (hay exopeptidaza): Chủ yếu phân cắt các liên kết peptit ở đầu, cuối mạch, giải phóng các axit amin tự do. Có tính đặc hiệu hẹp, chỉ tác dụng lên liên kết peptit tại những vị trí nhất định.
- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidazae đƣợc chia thành hai loại [120, 122]:
+ Aminopeptidaza: Xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của chuỗi polypeptit để giải phóng ra amino axit, một dipeptit hoặc một tripeptit. + Carboxypeptidaza: Xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu C của chuỗi polypeptit và giải phóng ra một amino axit hoặc một dipeptit.
- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidaza đƣợc chia thành bốn nhóm [120,122]:
+ Serin proteinaza: Là những proteinaza chứa nhóm –OH của gốc serin trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzym. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzym, động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, elastaza.
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzym vi khuẩn nhƣ subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serin proteinaza thƣờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng.
+ Cystein proteinaza: Là các proteinaza chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinaza bao gồm các proteinaza thực vật nhƣ papain, bromelin, một vài protein động vật và proteinaza ký sinh trùng. Các cystein proteinaza thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinaza: Hầu hết các aspartic proteinaza thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepxin bao gồm các enzym tiêu hóa nhƣ: pepxin, chymosin, cathepsin, renin.
46
Các aspartic proteinaza có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinaza (Proteinaza kim loại): Là nhóm proteinaza gặp ở VK, nấm mốc cũng nhƣ các VSV bậc cao hơn. Các metallo proteinaza thƣờng hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA.
- Ngoài ra, proteaza đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: proteaza axit; proteaza trung tính; proteaza kiềm có pH hoạt động lần lƣợt là: pH 2- 4, pH 7-8, pH 9-11 [120, 122].
1.2.3.2. Vi sinh vật tổng hợp enzym phân giải protein
* Vi khuẩn
Lƣợng proteaza sản xuất từ vi khuẩn ƣớc tính vào khoảng 500 tấn/năm, chiếm 59% lƣợng enzym đƣợc sử dụng. Proteaza của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidaza hoặc exopeptidaza, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên. Do đó proteaza của vi khuẩn, có tính đặc hiệu cao với cơ chất. Có khả năng phân hủy tới 80%, các liên kết peptit trong phân tử protein một cách nhanh chóng. Ngoài ra, có thể phân huỷ một số liên kết không đặc trƣng [120, 122].
Các loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh proteaza là: Bacillus subtilis
[2, 19, 20, 29, 74], B. horikoshii [76], B. mesentericus, B. thermoproteolyticus, B. polymyxa [68], B. mojavensis [35] và một số loài thuộc chi Serratia sp [19], Vibrio fluvialis [88], Clostridium, Pseudomonas [64], Pseudomonas aeruginosa [64, 93, 97]. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp proteaza mạnh nhất [2, 19, 20, 74].
Các vi khuẩn thƣờng tổng hợp các proteaza hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
+ Các proteaza trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các proteaza trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với proteaza động vật đồng thời làm tăng giá trị dinh dƣỡng. Các proteaza trung tính có ái lực cao đối với các amino axit ƣa béo và thơm.
47
+ Proteaza của Bacillus ƣa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lƣợng phân tử từ 20.000 đến 30.000, ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng (7-12) [19, 20, 29, 68, 74, 76, 78].
* Nấm
Nhiều loài nấm mốc có khả năng tổng hợp proteaza và đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhƣ: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum…Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại proteaza: axit, kiềm và trung tính.
Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các proteaza axit có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3. Một số nấm mốc khác nhƣ: A. candidatus, P. camemberti, P. roqueforti…cũng có khả năng tổng hợp proteaza, có khả năng làm đông tụ sữa đƣợc sử dụng trong sản xuất pho mát [Theo 7, 12, 119, 120, 122].
* Xạ khuẩn
Trong các nhóm vi sinh vật tổng hợp proteaza, xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên ngƣời ta cũng đã tìm đƣợc một số loài có khả năng tổng hợp proteaza cao nhƣ: Streptomyces griseus, S. fradiae, S. trerimosus…[Theo 7, 119, 120, 122].
Chế phẩm proteaza từ xạ khuẩn đƣợc biết nhiều là Pronase (Nhật) đƣợc tách chiết từ S. grieus. Enzym này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90%