* Xác định hoạt độ proteaza theo phương pháp Anson cải tiến
Một đơn vị hoạt động proteaza (HP) là lƣợng enzym có khả năng phân giải protein trong 1 phút ở 300C và pH thích hợp tạo thành các sản phẩm hoà tan trong axit tricloaxetic (TCA). Cho phản ứng mầu với thuốc thử Folin-Ciocalteu tƣơng đƣơng với 1micromol tyrozin [Theo 19, 20].
Hỗn hợp thí nghiệm bao gồm 0,5ml dung dịch enzym, 1 ml cơ chất giữ ở 300C trong 20 phút. Dừng phản ứng bằng 2,5 ml dung dịch axit tricloaxetic (TCA) 5%, lắc đều, giữ ở 30phút. Mẫu kiểm tra cho TCA vào dung dịch enzym trƣớc khi cho cơ chất. Sản phẩm phản ứng đƣợc xác định bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, so màu trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 750 nm.
Lấy hiệu số số đọc trên máy giữa ống thí nghiệm và ống kiểm tra. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin để tính micromol tyrozin tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm tạo thành dƣới tác dụng của enzym. Hoạt độ phân giải protein của 1ml dung dịch enzym mẫu (PA) cần xác định đƣợc tính theo công thức.
HP/ml = ( micromol Tyr x 4 x 2) /t = Đơn vị phản ứng 4: Toàn bộ thể tích hỗn hợp phản ứng
2: Tính trên 1 ml dung dịch enzym đem xác định t: thời gian ủ enzym với cơ chất
* Nghiên cứu độ bền của proteaza
- Ảnh hưởng của các ion kim loại: Thu enzym từ dịch nuôi cấy vi khuẩn, bổ sung các ion kim loại với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10-3M. Sau 10 phút xác định lại hoạt độ của enzym. Lấy giá trị hoạt độ của enzym ban đầu làm đối chứng, coi giá trị đó là 100% để so sánh với các giá trị đƣợc xác định sau khi ủ enzym đƣợc bổ sung các ion kim loại khác nhau [Theo 7, 19, 20].