1.2.1.1. Xenluloza
Xenluloza là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật với tỷ lệ trong khoảng 30- 80% tính theo khối lƣợng khô. Xenluloza là một polyme mạch thẳng bao gồm nhiều gốc anhydroglucoza gắn với nhau nhờ liên kết -1,4 glycozit, chúng liên kết chặt chẽ với các polisacarit khác nhƣ hemi-xenluloza, pectin và linhin tạo thành những phức hợp bền vững. Gốc hydroglucoza có dạng ghế bành, gốc đứng sau tạo góc quay 180o so với gốc đứng trƣớc. Mỗi phân tử xenluloza thƣờng chứa 10.000-14.000 gốc glucoza, khối lƣợng tƣơng ứng là 1,5 triệu kDa, với chiều dài phân tử có thể lớn hơn hoặc bằng 5 m [4, 7, 85].
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử xenluloza Hình 1.4. Chuỗi các đơn phân hydroxyetyl xenluloza
Xenluloza có cấu trúc lớp sợi song song, các chuỗi xenluloza gắn với nhau nhờ mạng lƣới liên kết hydro, còn các lớp gắn với nhau nhờ lực Van-der-Van, các
35
sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi, những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Phân tử xenluloza có cấu trúc không đồng nhất, thƣờng có hai vùng xen kẽ: Vùng kết tinh có trật tự cao và bền vững với các tác động bên ngoài và vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ, do đó kém bền vững hơn. Vùng vô định hình có thể hấp thụ nƣớc và trƣơng lên, do vậy dễ bị enzym tấn công. Trong khi đó ở vùng kết tinh, mạng lƣới liên kết hydro ngăn cản sự trƣơng này, các dung môi hữu cơ, các dung dịch axit hay kiềm loãng cũng không có tác dụng, các enzym chỉ có thể tác dụng lên bề mặt của các sợi [4, 7, 85].
Xenluloza là hợp chất phức tạp và bền vững không tan trong nƣớc và trong nhiều dung môi hữu cơ, không bị các dung dịch axit và kiềm loãng tác dụng, chỉ bị thuỷ phân khi đun nóng với axit hoặc kiềm. Do liên kết glycozit không bền với axit, xenluloza dễ bị thuỷ phân bởi axit thành các sản phẩm thuỷ phân không hoà tan, có độ bền cơ học kém hơn.
Xenluloza tự nhiên khi bị thuỷ phân hoàn toàn sẽ cho sản phẩm cuối cùng là D-glucoza. Dung dịch kiềm làm trƣơng phồng mạch xenluloza và hoà tan một phần các xenluloza phân tử nhỏ. Trong khi đó ở điều kiện bình thƣờng (pH trung tính và nhiệt độ, áp suất thƣờng) một số vi sinh vật có thể thuỷ phân xenluloza thành xenlobioza, sau đó dƣới tác động của xenlobioza thành glucoza [39, 40, 42].
1.2.1.2. Enzym xenlulaza
Xenlulaza là một phức hệ các enzym hoạt động cùng nhau để thuỷ phân xenluloza, tạo ra các loại đƣờng đi qua thành tế bào vi sinh vật. Nhiều tác giả cho rằng phức hệ xenlulaza bao gồm 3 enzym chủ yếu sau đây [48, 49, 52, 63, 65, 89]:
- Endo-1,4-glucanaza (hay CMC-aza, Cx) tác động lên chuỗi xenluloza một cách tuỳ tiện và phân huỷ liên kết -1,4-glycozit giải phóng xenlobioza và glucoza. Enzym này thuỷ phân CMC hoặc xenluloza theo kiểu tuỳ tiện, làm giảm nhanh chiều dài chuỗi và tăng chậm các nhóm khử, tác dụng lên xenlodextrin.
Enzym này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhƣng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh.
36
- Exo-1,4-glucanaza (hay xenlobiohydrolaza, C1,) giải phóng xenlobioza hoặc glucoza từ đầu không khử của xenluloza, tác dụng yếu lên CMC, nhƣng tác dụng rất mạnh lên xenluloza vô định hình hoặc xenluloza đã bị phân giải một phần; tác dụng lên xenluloza kết tinh không rõ nhƣng khi có mặt endoglucanaza thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
- -1,4-glucozidaza (hay xenlobiaza) thuỷ phân xenlobioza và các xenlodextrin khác hoà tan trong nƣớc, chúng có hoạt tính cao trên xenlobioza, còn đối với xenlodextrin thì có hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Tuỳ theo vị trí mà -glucozidaza đƣợc coi là nội bào, ngoại bào hoặc liên kết với thành tế bào.
Mỗi enzym thành phần, có thể gồm một vài izozim khác nhau về khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và hàm lƣợng polisacarit liên kết. Kết quả các công trình nghiên cứu cho thấy: tính đa hình của xenlulaza, nhằm phù hợp với cấu trúc phức tạp của mạch phân tử xenlulaza, gồm nhiều vùng có hoạt tính thuỷ phân khác nhau. Tuỳ thuộc vào loài vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ các enzym thành phần trong phức hệ xenlulaza và hiệu lực phân giải xenluloza của xenlulaza khác nhau, nhƣng để phân giải hoàn toàn xenluloza tự nhiên, cần có sự tác dụng hiệp đồng của cả ba thành phần trong phức hệ xenlulaza. Quá trình tổng hợp xenlulaza chịu sự điều khiển của bộ máy di truyền, quá trình sinh hoá do các chất cảm ứng, sự kiềm chế bởi các chất trao đổi trung gian và các sản phẩm cuối cùng [85, 89, 100].
Xenlulaza có mặt trong nhóm vi sinh vật, nhƣ ở nhiều loài vi nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn. Có ít nhất hai bƣớc trong phân hủy xenluloza do VSV.
Bƣớc 1: Tiền thuỷ phân (prohydrolytic). Trong bƣớc này một enzym (C1) sẽ làm trƣơng (swell) hoặc hydrat hoá các mạch glucoza khan.
Bƣớc 2: sử dụng các enzym thủy phân (Cx) và -glucosidaza (xenlobiaza). Gilbert và Hazelwood [62] đã nghiên cứu về phức enzym của xenluloza. Phức này chuyển hoá xenluloza tinh thể, vô định hình thành glucoza. Glucoza sau khi giải phóng đƣợc xác định Hexokinaza/glucoza-6-photphat ở bƣớc sóng 340 nm.
37
Trong thực tế, vi sinh vật tổng hợp xenlulaza mạnh nhất trên môi trƣờng có hàm lƣợng xenluloza hay chất cảm ứng thích hợp. Vì vậy, sự tổng hợp xenlulaza có tính cảm ứng không chặt chẽ bởi xenluloza là cơ chất không tan, phân tử lớn, bản thân không thể thâm nhập vào tế bào để gây ra các phản ứng sinh hoá. Theo Gilbert và Hazelwood [62], xenluloza không phải là chất cảm ứng trực tiếp mà khi ở ngoài môi trƣờng chúng bị thuỷ phân bởi một lƣợng nhỏ enzym cấu trúc thành xenlobioza; Chất này có thể thấm vào tế bào qua màng và đƣợc coi là chất cảm ứng sinh lý, nhƣng nếu nồng độ xenlobioza cao thì sẽ kìm hãm tổng hợp xenlulaza. Nhằm mục đích thu đƣợc nguồn enzym cao, thƣờng sử dụng các cơ chất không dễ thuỷ phân nhƣ: bã mía, rơm rạ, giấy loại [65, 67] hoặc có thể nuôi kết hợp với các vi sinh vật đồng hoá tốt xenluloza.
1.2.1.3. Vi sinh vật tổng hợp xenlulaza
Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza vô cùng phong phú, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm.
* Vi khuẩn
Là nhóm vi sinh vật đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Năm 1785, lần đầu tiên Popove đã phát hiện rằng vi khuẩn kỵ khí tham gia vào quá trình lên men xenluloza. Trong thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã phân lập đƣợc một số vi sinh vật kị khí có khả năng phân giải xenluloza từ phân và dạ cỏ của động vật nhai lại. Năm 1902 Omelianski đã thuần khiết và mô tả hai chi vi khuẩn với hai kiểu lên men xenluloza: lên men hydro do loài Bacillus cellulosae hydrogenicus và lên men metan do
Bacillus cellulosae metanicus; chúng là vi khuẩn ƣa ấm với nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu 30-350C [4, 7]. Đầu thế kỷ XX, các nhà khoa học cũng đã phân lập đƣợc các vi khuẩn hiếu khí ƣa ấm, ƣa nhiệt cũng có khả năng này [40, 47]. Đến nay hàng loạt các công trình nghiên cứu cho thấy rất nhiều VSV có khả năng phân giải xenluloza.
Trong điều kiện kỵ khí có các loài vi khuẩn phân giải xenluloza (điển hình là các vi khuẩn trong dạ cỏ của động vật nhai lại) nhƣ: Clostridium, Ruminococcus flavofeciens, Bacteroides succienpgennes [4, 7, 12, 24, 39]…Trong điều kiện hiếu
38
khí có các loài phân giải xenluloza ƣa ấm hoặc ƣa nhiệt nhƣ: Pseudomonas fluorescens [48, 62, 65], Cellulomonas fimi (tạo thành 10 endogluconaza) [89],
Bacillus subtilis (tổng hợp một endogluconaza giống ở nấm), Cellvibrio, Azotobacter, Flavobacterium, Archromobacter, Bacillus pumilus [4, 7, 12, 24, 80]…Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải xenluloza, niêm vi khuẩn là quan trọng nhất, thƣờng có dạng hình que nhỏ, hơi uốn cong, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các chi Cytophaga, Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận năng lƣợng khi oxy hoá các sản phẩm của quá trình phân giải xenluloza thành CO2 và H2O [47, 48].
* Xạ khuẩn
Xạ khuẩn phân giải xenluloza đƣợc tìm thấy trong tất cả các loại đất, mùn rác và những nơi có chứa xenluloza, xenlulaza của xạ khuẩn là enzym ngoại bào. Kết quả phân lập cho thấy xạ khuẩn có mặt trong tất cả các mẫu mùn rác ở các mùa trong năm, số lƣợng xạ khuẩn phụ thuộc vào loại đất và tính chất của đất [4, 24, 32]. Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt, kích thƣớc tế bào nhỏ nhƣ vi khuẩn nhƣng đặc trƣng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất, Gram (+) và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm nhiệt độ sinh trƣởng, ngƣời ta chia xạ khuẩn thành hai dạng: + Xạ khuẩn ƣa ấm: Sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 25-37oC.
+ Xạ khuẩn ƣa nhiệt: Sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 45-70oC.
Các nhóm xạ khuẩn phân giải xenluloza chính: Streptomyces, Nocardia, Thermoactinomyces, Thermomonospora, Micromonospora…[4, 23, 32, 44, 67].
* Nấm sợi
Nấm sợi phân giải xenluloza mạnh hơn vi khuẩn vì chúng tiết vào môi trƣờng lƣợng enzym ngoại bào nhiều hơn vi khuẩn. Vi khuẩn thƣờng tiết vào môi trƣờng phức hệ xenlulaza không hoàn chỉnh, thuỷ phân đƣợc cơ chất đã cải biến nhƣ giấy lọc và CMC còn nấm tiết hệ xenlulaza hoàn chỉnh nên có thể thuỷ phân xenluloza hoàn toàn.
39
Các loài nấm đƣợc nghiên cứu nhiều là: Trichoderma reesei, Aspergillus, Verticillium, T. viride, Fusarium solanii, Penicillium pinophinum, Phanerochatae chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum và Sclerotium rolfs [48, 49, 98, 100].
Nấm sinh trƣởng và sản xuất xenlulaza mạnh khi độ ẩm cao và ở nhiệt độ 20- 300C, pH 3,5- 6,6. Nấm thƣờng phân hủy xenluloza ở giai đoạn cuối của quá trình ủ, khi nhiệt độ đống ủ đã giảm xuống. Tuy nhiên có một số nấm ƣa nhiệt (40- 450C) có thể tổng hợp các enzym chịu nhiệt; chúng sinh trƣởng nhanh và phân giải xenluloza nhƣng hoạt tính xenlulaza của dịch lọc lại thấp [40, 61].
1.2.2. Vi sinh vật thủy phân tinh bột 1.2.2.1. Cấu trúc của tinh bột 1.2.2.1. Cấu trúc của tinh bột
Trong tự nhiên, tinh bột tồn tại dƣới dạng các hạt có kích thƣớc 0,002- 0,12 mm phụ thuộc vào nguồn gốc tinh bột. Ngoài cùng của hạt tinh bột là lớp vỏ xenluloza chứa ít nƣớc nên bền với tác động bên ngoài, bên trong là lớp tinh bột. Với cấu trúc này tinh bột ít chịu ảnh hƣởng của axit hoặc enzym. Khi phá vỡ cấu trúc này bằng nhiệt thì các hạt tinh bột hấp thụ nƣớc, phồng lên, dính vào nhau làm độ nhớt tăng và gây hiện tƣợng hồ hoá. Nếu xử lý nhiệt lâu hơn, hạt tinh bột sẽ bị phân cắt do tác dụng thuỷ phân từng phần và hoà tan một phần các phân tử cấu thành tinh bột, độ nhớt của dung dịch giảm xuống.
Hình 1.5. Cấu trúc của
tinh bột Hình 1.6. Cấu trúc mạch amyloza Hình 1.7. Cấu trúc mạch amylopectin Đại phân tử tinh bột đƣợc tạo thành từ nhiều lớp đồng tâm: lớp ngoài là amylopectin, lớp trong là amyloza. Hai thành phần amyloza và amylopectin có tỷ lệ
40
đặc thù, thay đổi tùy theo từng loại tinh bột, amyloza thƣờng chiếm tỷ lệ 13- 37% còn amylopectin chiếm 63-87% [theo 7, 16].
Amyloza có cấu tạo dạng chuỗi không phân nhánh gồm khoảng 300-1000 gốc glucoza kết hợp với nhau qua liên kết -1,4 glycozit dài xoắn theo kiểu lò xo. Amyloza đƣợc kết tinh bằng rƣợu butylic. Amyloza không tan trong nƣớc lạnh mà dễ tan trong nƣớc ấm, tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao và không bền khi nhiệt độ hạ thấp [theo 7, 16].
Các dung dịch đậm đặc của amyloza nhanh chóng tạo nên dạng gel vô định hình, cứng, rắn hoặc co giãn, sau đó tạo thành tinh thể và kết tủa không thuận nghịch. Amyloza có xu hƣớng kết tinh vì nó có cấu tạo đơn giản, không cồng kềnh về mặt lập thể, tốc độ phân huỷ phụ thuộc vào pH, nồng độ, khối lƣợng phân tử và sự có mặt của các ion [59, 60, 81, 82].
Amylopectin có khối lƣợng phân tử 500.000-1.000.000 kDa, đƣợc cấu tạo bởi các gốc glucoza liên kết với nhau bằng cả kiên kết -1,4 glycozit và -1,6 glycozit. Một số nghiên cứu cho thấy trong phân tử cũng có cả liên kết -1,3 glycozit. Cấu trúc phân tử của nó bao gồm một mạch nhánh trung tâm (chứa liên kết
-1,4 glycozit) từ đó phát ra các nhánh phụ có chiều dài vài chục gốc glucoza. Điểm phân nhánh có liên kết -1,6 glycozit. Vì nó có cấu trúc mạch nhánh nên phân tử không tạo thành dạng xoắn ốc nhƣ amyloza [theo 7, 16].
Khi phản ứng với iot, amylopectin cho màu đỏ nâu (do kết quả của sự hình thành nên các hợp chất hấp phụ). Dung dịch amylopectin không có xu hƣớng kết tinh nên có khả năng giữ nƣớc. Khác với dung dịch amyloza, amylopetin có độ nhớt cao và bền hơn. Cả hai thành phần này đều đƣợc cấu tạo từ các đơn vị -D-glucoza qua liên kết 1-4 và 1-6 glycozit. Tinh bột không hoà tan trong nƣớc lạnh nhƣng bị hồ hoá khi đun nóng đến 60-80oC. Dƣới tác dụng của enzym amylaza hoặc axit mạnh, các liên kết glycozit bị phá huỷ để tạo thành phân tử thấp hơn. Sự thuỷ phân xảy ra ở hai mức độ là dịch hoá và đƣờng hoá. Sản phẩm chủ yếu của dịch hoá tinh bột là các polyglucoza tƣơng ứng (dextrin), còn sản phẩm của đƣờng hoá là glucoza hoặc maltoza [15, 41].
41
1.2.2.2. Enzym thuỷ phân tinh bột
Amylaza rất phổ biến ở vi sinh vật, thuộc nhóm enzym xúc tác cho sự phân giải liên kết nội phân tử trong polysacarit với sự tham gia của nƣớc. Cơ chất của amylaza là tinh bột và glycogen, theo tính chất và cách tác dụng lên tinh bột, phân biệt amylaza thành các loại: -amylaza, -amylaza, glucoamylaza và oligo 1-6 glucozidaza [37, 89, 114].
* -Amylaza (-1,4 glucan-glucanhydrolaza )
-amylaza từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm giống nhau. Phân tử lƣợng của các -amylaza từ các nguồn khác nhau xấp xỉ 40.000 kDa. -amylaza có khả năng phân cắt các liên kết -1,4 glycozit nằm phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên không tuân theo trình tự nào. Liên kết -1,6 glycozit không bị thuỷ phân sẽ phong toả các liên kết -1,4 gần nó, làm cho -amylaza không đƣợc tác dụng, vì thế với amylopectin thì sản phẩm tạo ra là các dextrin chứa cả liên kết - 1,4 và -1,6 glycozit.
Khi tác dụng lên tinh bột, enzym này giải phóng glucoza ở dạng - amutanmer nên đƣợc gọi là -amylaza. -amylaza có khả năng thuỷ phân tinh bột và thuỷ phân bột thô. Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm nhiều giai đoạn khác nhau. Thông thƣờng thì -amylaza chỉ thuỷ phân tinh bột thành các phân tử dextrin có khối lƣợng phân tử thấp (không cho màu xanh với iot) và một ít maltoza. -amylaza dễ tan trong nƣớc, trong các dung dịch muối và rƣợu loãng. Các protein -amylaza có tính chất axit béo và tính chất của globulin, điểm đẳng điện nằm trong phạm vi vùng 4,2- 5,7 [theo 7, 16, 96].
-amylaza là một metalo enzym trong phân tử có chứa ion canxi, khi tách hoàn toàn Ca2+ ra khỏi phân tử thì enzym bị mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất vì Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc III và duy trì cấu hình của enzym. -amylaza bền nhiệt hơn so với các amylaza khác, tất cả các - amylaza đều bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng nhƣ Cu2+, Hg2+, Ag2+... Một loạt các ion kim loại nhƣ Li+, Na+, Mg2+, Cr3+, Mn2+, Co2+, Sn2+, Cd2+ không có ảnh hƣởng đến -
42
amylaza, điều kiện hoạt động của -amylaza từ các nguồn khác nhau thƣờng không giống nhau [Theo 7, 51, 59, 60, 73, 82].
Những khác biệt về tính chất (nhiệt độ, pH tối thích, mức độ thuỷ phân và đặc tính thuỷ phân) của -amylaza từ các nguồn khác nhau đã mở ra triển vọng to lớn cho việc ứng dụng chúng một cách thích hợp và hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất [15, 21, 37, 41].
* -Amylaza (-1,4 Glucan maltohydrolaza)
-Amylaza xúc tác thuỷ phân liên kết 1-4 glycozit trong tinh bột, glycogen và polysacarit đồng loại, phân cắt tuần tự gốc glucoza từ đầu không khử của mạch.
-amylaza hầu nhƣ không thuỷ phân hạt tinh bột nguyên vẹn mà thuỷ phân mạnh mẽ hồ tinh bột. -amylaza phân giải 100% amyloza thành matoza và phân giải 54- 55% amylopectin thành matoza. Matoza tạo thành có cấu hình , vì thế enzym tƣơng ứng đƣợc gọi là -amylaza. -Amylaza có trung tâm xúc tác chứa các nhóm -