Phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và định danh theo khoá phân loại của Bergey. Bốn chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có pH, nhiệt độ và thời gian thích hợp cho từng chủng, quan sát hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch đĩa và khả năng sinh trƣởng, các đặc điểm sinh hoá trong môi trƣờng dịch thể. Hình dạng, kích thƣớc tế bào của 4 chủng đƣợc xác định trên kính hiển vi điện tử quét với sự hỗ trợ thiết bị và kỹ thuật của Phòng Kính hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW.
* Chủng xạ khuẩn XK112
Chủng xạ khuẩn XK112 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gauze ở nhiệt độ 35- 370C. Sau 72 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc có hình tròn, bề mặt khô, nhăn, đƣờng kính 2- 2,5 mm, màu trắng xám, chân khuẩn lạc bám sâu vào môi trƣờng thạch.
Trong môi trƣờng dịch thể lắc sau 72 giờ, chủng xạ khuẩn XK112 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤ 1 mm, làm trong môi trƣờng nuôi cấy, tạo váng màu trắng bám vào thành bình, mật độ tế bào đạt 2,6 x 109 CFU/ml. Sau khi nuôi tĩnh 72- 96 giờ, mật độ tế bào đạt 4,2 x 106 CFU/ml, dịch thể phía dƣới ở dạng huyền phù, tạo các hạt tròn nhỏ, phía trên trong hơn, bề mặt môi trƣờng không đóng váng. Chủng XK112 sinh trƣởng và phân nhánh tạo thành hệ khuẩn ty. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét cho thấy chuỗi bào tử dạng thẳng, mỗi chuỗi có từ 15 đến 35 bào tử.
86 * Chủng vi khuẩn B20
Chủng B20 thuộc vi khuẩn Gram (+), hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Trên môi trƣờng King B ở nhiệt độ 300C, sau 48 giờ khuẩn lạc khô, màu nâu nhạt, hình dạng không tròn đều, mép có thùy, có đƣờng kính 0,5-1 mm.
Hình 3.7. Hình dạng tế bào của chủng vi khuẩn B20
Trên môi trƣờng dịch thể lắc, sau 48 giờ chủng B20 sinh trƣởng làm môi trƣờng nuôi chuyển sang màu vàng nhạt, trên thành bình tạo vòng váng màu nâu nhạt. Mật độ tế bào sau 48 giờ nuôi cấy đạt 4,6 x 109 CFU/ml. Trong điều kiện nuôi tĩnh, sau 48-72 giờ chủng B20 sinh trƣởng làm đục môi trƣờng dịch thể, bề mặt môi trƣờng đóng váng, mật độ tế bào đạt 1,2 x 108 CFU/ml. Tế bào chủng B20 hình que, ngắn, kích thƣớc 5,2 x 0,8 m. Tạo bào tử hình ovan.
* Chủng vi khuẩn B15
Chủng vi khuẩn B15 thuộc thuộc nhóm hiếu khí không bắt buộc, Gram (+). Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng King B, nhiệt độ 300C, khuẩn lạc khô, màu vàng nhạt, lan trên mặt thạch, bề mặt khô nhăn, lồi ở tâm hoặc tạo lớp màng, mép xẻ thùy, có đƣờng kính 0,7-1 mm.
Trong môi trƣờng dịch thể, sau 48 giờ chủng vi khuẩn B20 sinh trƣởng làm môi trƣờng nuôi cấy chuyển màu vàng nhạt, trên thành bình tạo vòng váng màu nâu nhạt. Mật độ tế bào lắc sau 48 giờ nuôi đạt 5,4 x 109 CFU/ml. Trong điều kiện nuôi tĩnh, sau 48-72 giờ chủng vi khuẩn B20 sinh trƣởng làm đục môi trƣờng dịch thể, bề mặt môi trƣờng đóng váng, mật độ tế bào đạt 4,2 x 106 CFU/ml.
87
Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét cho thấy tế bào hình que nhỏ, đứng riêng rẽ kích thƣớc 444 nm x 2,02 m, bào tử hình bầu dục.
Hình 3.8. Hình dạng, kích thƣớc tế bào của chủng vi khuẩn B15 * Chủng vi khuẩn LH19
Nuôi trên môi trƣờng MRS ở 32-350C sau 48 giờ, khuẩn lạc của chủng vi khuẩn LH19 có hình dạng tròn nhỏ, màu trắng sữa, bề mặt mịn, tạo vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch MRS bổ sung 0,5% CaCO3. Chủng vi khuẩn LH19 không di động, không sinh bào tử, bắt màu Gram (+), thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét cho thấy tế bào hình que, đứng riêng rẽ, kích thƣớc 514 nm 2,44 m.
88
Hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch đĩa của 4 chủng vi sinh vật nghiên cứu đƣợc thể hiện trên các hình từ 3.10 đến 3.13.
Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XK112
Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn B20
Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc
của chủng vi khuẩn B15 Hình 3.13. Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn LH19 Song song với việc đánh giá đặc điểm về hình thái, thử nghiệm khả năng đồng hoá các nguồn hydratcacbon, thuỷ phân cazein, gelatin và một số phản ứng cần thiết khác cũng đƣợc tiến hành để xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi sinh vật. Kết quả trong bảng 3.8 cho thấy:
- Chủng xạ khuẩn XK112 sử dụng đƣợc nguồn hydratcacbon khá đa dạng, ngoài các loại đƣờng, chủng XK112 vừa có khả năng phân giải CMC vừa có khả năng thuỷ phân tinh bột.
- Chủng vi khuẩn B20 có khả năng đồng hoá tốt với tất cả 4 nguồn đƣờng đặc trƣng thƣờng dùng cho phân loại vi khuẩn đồng thời có khả năng phân giải gelatin, tinh
89 bột và CMC, phản ứng xitrat dƣơng tính.
-Chủng vi khuẩn B15 có khả năng đồng hoá các nguồn đƣờng đặc trƣng: glucoza, sacaroza, fructoza, galactoza…Không đồng hóa lactoza nhƣng có khả năng phân giải cazein, gelatin và tinh bột, phản ứng xitrat âm tính.
-Chủng LH19 đồng hóa hầu hết các nguồn hydratcacbon: fructoza, glucoza, galactoza, raffinoza...Có khả năng thuỷ phân tinh bột và không đồng hoá manitol.
Cả 4 chủng đều có khả năng đồng hóa đa dạng với các nguồn hydratcacbon, trong đó có chủng vừa có khả năng phân giải CMC hoặc tinh bột vừa có khả năng thuỷ phân gelatin, cazein. Đặc tính này thuận lợi cho việc lựa chọn môi trƣờng nhân sinh khối để sản xuất, đồng thời phù hợp với mục đích sử dụng 4 chủng vi sinh vật này để xử lý chất thải chăn nuôi giàu các hợp chất hydratcacbon và protein.
Bảng 3.8. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
Khả năng đồng hóa Chủng XK112 Chủng B20 Chủng B15 Chủng LH19 D - glucoza + + + + L - arabinoza + + +/- +/- D - manitol - +/- +/- - D - xyloza + + + + D- fructoza + +/- + + Lactoza +/- +/- - + Maltoza +/- + + + Sacaroza + +/- + + Galactoza +/- +/- + + D- rhamnoza + +/- +/- +/- D- raffinoza + +/- +/- + Inositol + kxđ kxđ kxđ Cazein +/- + + +/- Gelatin +/- + + +/- Tinh bột + + + + CMC + + +/- +/- Phản ứng catalaza + - Phản ứng xitrat + - Indol - - Chú thích: (+) Có phản ứng; (-) Không có phản ứng; (+/-): Không xác định
90
Căn cứ vào kết quả đánh giá đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hoá, dựa trên khoá phân loại của Bergey [69, 70, 110], 4 chủng vi sinh vật nghiên cứu đƣợc sơ bộ định danh nhƣ sau:
+ Chủng XK112 thuộc chi Streptomyces, có nhiều đặc điểm giống loài S. griseosporeus;
+ Chủng B20 thuộc chi Bacillus, có nhiều đặc điểm giống loài B. Licheniformis
+ Chủng B15 thuộc chi Bacillus, có nhiều đặc điểm giống loài B. subtilis
+Chủng LH19 thuộc chi Lactobacillus có nhiều đặc điểm giống loài L. plantarum.