Định tên vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Một phần của tài liệu Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn (Trang 88 - 92)

Để khẳng định chính xác tên loài của 4 chủng XK112, B20, B15 và LH19, chúng tôi đã sử dụng phối hợp phƣơng pháp định danh truyền thống với phƣơng phƣơng pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử thông qua việc xác định trình tự ADNr 16S của 4 chủng vi sinh vật trên.

Đoạn gien đƣợc khuếch đại nhờ phản ứng chuỗi trùng hợp sử dụng cặp mồi (theo 2.2.1.2). Từ ADN thang chuẩn 10.000 bp, kết quả nghiên cứu xác định đƣợc chủng cần định danh cho sản phẩm PCR đƣợc nhân lên nằm trong khoảng kích thƣớc nucleotit nào.

Để thực hiện việc xác định trình tự, trƣớc hết phải chuyển phân tử ADN mạch kép thành phân tử ADN mạch đơn, biến tính phân tử ADN mạch kép qua PCR. Xác định trật tự ADN tự động đƣợc dựa trên phƣơng pháp kết thúc chuỗi và đoạn trình tự đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp xác định tự động.

Sau khi loại bỏ lỗi của việc bắt cặp sai trong quá trình phân tích, dữ liệu đƣợc gửi vào ngân hàng dữ liệu gien, so sánh đoạn nucleotit phân tích với trình tự gien của đoạn ADNr 16s đã đƣợc đăng ký trong ngân hàng gien.

Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh với dữ liệu trên GenBank bằng công cụ Blast Search sử dụng cho việc lập cây phát sinh chủng loại trong phân tích nguồn gốc tiến hoá của các chủng nghiên cứu với các mối quan hệ khác trong hệ thống phát sinh chủng loại.

91 * Chủng XK112

Chủng xạ khuẩn XK112 có trình tự gien ARNr 16S tƣơng đồng tới 99,6% (1245/1250 bp) so với trình tự của chủng xạ khuẩn Streptomyces griseosporeus có ký hiệu AB184419. Mối quan hệ gần giữa chủng XK112 với trình tự nucleotit các loài thuộc Streptomyces trong ngân hàng dữ liệu gien cho thấy XK112 nằm cùng nhánh với loài Streptomyces griseosporeus trên cây phát sinh.

Hình 3.14. Cây phát sinh dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S của chủng XK112 với các loài có quan hệ gần

* Chủng B20

ADN của chủng vi khuẩn B20 đƣợc dùng làm khuôn để khuếch đại đoạn ADN bằng phản ứng PCR. Xác định trình tự ADNr 16S, so sánh mối quan hệ trình tự nucleotit trong ngân hàng gien và xây dựng cây phát sinh chủng loại.

Trình tự gien ARNr 16S của chủng vi khuẩn B20 tƣơng đồng 99,93 % (1429/1430 bp) với đoạn 16S của Bacillus licheniformis X68416. Quan sát trên cây phả hệ, chủng B20 nằm cùng vị trí với Bacillus licheniformis X68416.

Kitasatosporia setalbaStreptomyces thermodiastaticus_U93332 _ AB249928

XK112

Streptomyces griseosporeus_ AB184419

Streptomyces thermocoprophilus AB249938

Streptomyces tricolor_AY999880

Streptomyces bangladeshensis_ AY750056

Streptomyces rameusStreptomyces cinereospinus_AB184679 _ EU593556

Streptomyces albogriseolus_ GQ925802

Streptomyces indiaensis_ AB184553

Streptomyces viridis_GQ268026

Streptomyces iakyrus_AB184877

Streptomyces bellus_FJ532419

Streptomyces coeruleorubidus_ EU841625

Streptomyces althioticus_ EU593734

Streptomyces thermocarboxydus_ AB249926

Streptomyces aureus_EF371429

Streptomyces spinoverrucosus_ EU593714

92

Hình 3.15. Cây phát sinh dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S của chủng B20 với các loài có quan hệ gần * Chủng B15

Kết quả giải trình tự các nucleotit cho thấy trình tự gien ARNr 16S của chủng vi khuẩn B15 tƣơng đồng 99,86 % (1449/1451 bp) với đoạn 16S của chủng

Bacillus subtilis ký hiệuAJ276351.

Mối quan hệ gần giữa chủng B15 với trình tự nucleotit các loài thuộc

Bacillus trong ngân hàng dữ liệu gien cho thấy chủng vi khuẩn B15 nằm trên cùng nhánh của cây phát sinh với loài Bacillus subtilis AJ276351

Staphylococcus aureus_X68417

Bacillus cibi_AY550276

Bacillus indicus_AJ583158

Bacillus idriensis_AY904033

100

Bacillus isabeliae_AM503357

Bacillus safensis_AF234854

Bacillus pumilus_AY876289

Bacillus altitudinis_AJ831842

Bacillus aerophilus_AJ831844

Bacillus stratosphericus_AJ831841

100 99 100

B20

Bacillus aerius_AJ831843

Bacillus licheniformis_X68416

90

Bacillus sonorensis_AF302118

100

Bacillus atrophaeus_Bacillus velezensis_AY603658 AB021181

Bacillus nematotocita_AY820954

Bacillus amyloliquefaciens_X60605

58

Bacillus vallismortis_Bacillus subtilis_AB042061 AB021198

Bacillus subtilisBacillus axarquiensis subsp spizizenii_AY603657 _AF074970

Bacillus malacitensisBacillus mojavensis_AB021191 _AY603656

57 51 56 75 59 68 100 99 100 97 86 100 58 0.01

93

Hình 3.16. Cây phát sinh dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S của chủng B15 với các loài có quan hệ gần

* Chủng LH19

Kết quả đọc trình tự ADNr 16S của chủng LH19 đƣợc xử lý và so sánh với dữ liệu trên GenBank bằng công cụ Blast Search. Cây phả hệ đƣợc xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S của chủng nghiên cứu với các loài đã biết gần gũi nhất

Lactobacillus, Weissella viridescens đƣợc sử dụng làm nhóm ngoài.

Quan sát trên cây phả hệ (hình 3.17) cho thấy, chủng LH19 nằm cùng vị trí với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum).

Kết quả so sánh trình tự ADNr 16S của chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài đã biết cho thấy chủng vi khuẩn LH19 có mức tƣơng đồng 99,9% với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum.

Staphylococcus aureus_X68417

Bacillus megaterium_D16273

Bacillus simplex_AJ439078

Bacillus indicus_AJ583158

Bacillus isabeliae_AM503357

Bacillus pumilus_AY876289

Bacillus licheniformis_X68416

Bacillus atrophaeus_AB021181

Bacillus subtilis_AJ276351

B15

Bacillus axarquiensis_DQ993671

Brevibacterium halotolerans_ AM747812

Bacillus mojavensis_AB021191

94

70 81

Bacillus nematotocita_AY820954

Bacillus vallismortis_AB021198

Bacillus polyfermenticus_ DQ659145

Bacillus velezensis_AY603658

Bacillus amyloliquefaciens_X60605 68 59 96 54 65 99 98 98 53 95 52 0.01

94

Hình 3.17. Cây phát sinh dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S của chủng LH19 với các loài có quan hệ gần

Căn cứ vào kết quả định danh theo phƣơng pháp truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa) và kết hợp với kết quả định danh theo phƣơng pháp sinh học phân tử (dựa trên kết quả giải trình tự các nucleotit và thiết lập cây phả hệ) cho phép khẳng định: chủng xạ khuẩn XK112 thuộc chi Streptomyces griseosporeus, chủng vi khuẩn B20 là Bacillus licheniformis, chủng vi khuẩn B15 là

Bacillus subtilis và chủng vi khuẩn LH19 là Lactobacillus plantarum.

Một phần của tài liệu Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn (Trang 88 - 92)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(176 trang)