Để khẳng định chính xác tên loài của 4 chủng XK112, B20, B15 và LH19, chúng tôi đã sử dụng phối hợp phƣơng pháp định danh truyền thống với phƣơng phƣơng pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử thông qua việc xác định trình tự ADNr 16S của 4 chủng vi sinh vật trên.
Đoạn gien đƣợc khuếch đại nhờ phản ứng chuỗi trùng hợp sử dụng cặp mồi (theo 2.2.1.2). Từ ADN thang chuẩn 10.000 bp, kết quả nghiên cứu xác định đƣợc chủng cần định danh cho sản phẩm PCR đƣợc nhân lên nằm trong khoảng kích thƣớc nucleotit nào.
Để thực hiện việc xác định trình tự, trƣớc hết phải chuyển phân tử ADN mạch kép thành phân tử ADN mạch đơn, biến tính phân tử ADN mạch kép qua PCR. Xác định trật tự ADN tự động đƣợc dựa trên phƣơng pháp kết thúc chuỗi và đoạn trình tự đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp xác định tự động.
Sau khi loại bỏ lỗi của việc bắt cặp sai trong quá trình phân tích, dữ liệu đƣợc gửi vào ngân hàng dữ liệu gien, so sánh đoạn nucleotit phân tích với trình tự gien của đoạn ADNr 16s đã đƣợc đăng ký trong ngân hàng gien.
Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh với dữ liệu trên GenBank bằng công cụ Blast Search sử dụng cho việc lập cây phát sinh chủng loại trong phân tích nguồn gốc tiến hoá của các chủng nghiên cứu với các mối quan hệ khác trong hệ thống phát sinh chủng loại.
91 * Chủng XK112
Chủng xạ khuẩn XK112 có trình tự gien ARNr 16S tƣơng đồng tới 99,6% (1245/1250 bp) so với trình tự của chủng xạ khuẩn Streptomyces griseosporeus có ký hiệu AB184419. Mối quan hệ gần giữa chủng XK112 với trình tự nucleotit các loài thuộc Streptomyces trong ngân hàng dữ liệu gien cho thấy XK112 nằm cùng nhánh với loài Streptomyces griseosporeus trên cây phát sinh.
Hình 3.14. Cây phát sinh dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S của chủng XK112 với các loài có quan hệ gần
* Chủng B20
ADN của chủng vi khuẩn B20 đƣợc dùng làm khuôn để khuếch đại đoạn ADN bằng phản ứng PCR. Xác định trình tự ADNr 16S, so sánh mối quan hệ trình tự nucleotit trong ngân hàng gien và xây dựng cây phát sinh chủng loại.
Trình tự gien ARNr 16S của chủng vi khuẩn B20 tƣơng đồng 99,93 % (1429/1430 bp) với đoạn 16S của Bacillus licheniformis X68416. Quan sát trên cây phả hệ, chủng B20 nằm cùng vị trí với Bacillus licheniformis X68416.
Kitasatosporia setalbaStreptomyces thermodiastaticus_U93332 _ AB249928
XK112
Streptomyces griseosporeus_ AB184419
Streptomyces thermocoprophilus AB249938
Streptomyces tricolor_AY999880
Streptomyces bangladeshensis_ AY750056
Streptomyces rameusStreptomyces cinereospinus_AB184679 _ EU593556
Streptomyces albogriseolus_ GQ925802
Streptomyces indiaensis_ AB184553
Streptomyces viridis_GQ268026
Streptomyces iakyrus_AB184877
Streptomyces bellus_FJ532419
Streptomyces coeruleorubidus_ EU841625
Streptomyces althioticus_ EU593734
Streptomyces thermocarboxydus_ AB249926
Streptomyces aureus_EF371429
Streptomyces spinoverrucosus_ EU593714
92
Hình 3.15. Cây phát sinh dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S của chủng B20 với các loài có quan hệ gần * Chủng B15
Kết quả giải trình tự các nucleotit cho thấy trình tự gien ARNr 16S của chủng vi khuẩn B15 tƣơng đồng 99,86 % (1449/1451 bp) với đoạn 16S của chủng
Bacillus subtilis ký hiệuAJ276351.
Mối quan hệ gần giữa chủng B15 với trình tự nucleotit các loài thuộc
Bacillus trong ngân hàng dữ liệu gien cho thấy chủng vi khuẩn B15 nằm trên cùng nhánh của cây phát sinh với loài Bacillus subtilis AJ276351
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus cibi_AY550276
Bacillus indicus_AJ583158
Bacillus idriensis_AY904033
100
Bacillus isabeliae_AM503357
Bacillus safensis_AF234854
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus altitudinis_AJ831842
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841
100 99 100
B20
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
90
Bacillus sonorensis_AF302118
100
Bacillus atrophaeus_Bacillus velezensis_AY603658 AB021181
Bacillus nematotocita_AY820954
Bacillus amyloliquefaciens_X60605
58
Bacillus vallismortis_Bacillus subtilis_AB042061 AB021198
Bacillus subtilisBacillus axarquiensis subsp spizizenii_AY603657 _AF074970
Bacillus malacitensisBacillus mojavensis_AB021191 _AY603656
57 51 56 75 59 68 100 99 100 97 86 100 58 0.01
93
Hình 3.16. Cây phát sinh dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S của chủng B15 với các loài có quan hệ gần
* Chủng LH19
Kết quả đọc trình tự ADNr 16S của chủng LH19 đƣợc xử lý và so sánh với dữ liệu trên GenBank bằng công cụ Blast Search. Cây phả hệ đƣợc xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S của chủng nghiên cứu với các loài đã biết gần gũi nhất
Lactobacillus, Weissella viridescens đƣợc sử dụng làm nhóm ngoài.
Quan sát trên cây phả hệ (hình 3.17) cho thấy, chủng LH19 nằm cùng vị trí với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum).
Kết quả so sánh trình tự ADNr 16S của chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài đã biết cho thấy chủng vi khuẩn LH19 có mức tƣơng đồng 99,9% với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum.
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus megaterium_D16273
Bacillus simplex_AJ439078
Bacillus indicus_AJ583158
Bacillus isabeliae_AM503357
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus licheniformis_X68416
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus subtilis_AJ276351
B15
Bacillus axarquiensis_DQ993671
Brevibacterium halotolerans_ AM747812
Bacillus mojavensis_AB021191
94
70 81
Bacillus nematotocita_AY820954
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus polyfermenticus_ DQ659145
Bacillus velezensis_AY603658
Bacillus amyloliquefaciens_X60605 68 59 96 54 65 99 98 98 53 95 52 0.01
94
Hình 3.17. Cây phát sinh dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S của chủng LH19 với các loài có quan hệ gần
Căn cứ vào kết quả định danh theo phƣơng pháp truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa) và kết hợp với kết quả định danh theo phƣơng pháp sinh học phân tử (dựa trên kết quả giải trình tự các nucleotit và thiết lập cây phả hệ) cho phép khẳng định: chủng xạ khuẩn XK112 thuộc chi Streptomyces griseosporeus, chủng vi khuẩn B20 là Bacillus licheniformis, chủng vi khuẩn B15 là
Bacillus subtilis và chủng vi khuẩn LH19 là Lactobacillus plantarum.