3.2.1. Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật
Vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên. Muốn thúc đẩy nhanh quá trình xử lý chất thải chăn nuôi, ngoài việc đảm bảo các điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật sinh trƣởng cần
79
phải tuyển chọn, bổ sung các chủng vi sinh vật khởi động có hoạt tính sinh học cao để rút ngắn thời gian chuyển hóa, giảm thiểu ô nhiễm, nâng cao hiệu quả xử lý chất thải chăn nuôi. Mục tiêu của nghiên cứu là tuyển chọn các chủng vi sinh vật có các đặc điểm sau: có khả năng ức chế tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh và vi khuẩn sinh mùi hôi thối đồng thời phân giải nhanh chất hữu cơ; sinh trƣởng nhanh trong chất thải chăn nuôi, cạnh tranh với vi sinh vật tự nhiên trong chất thải song lại không ức chế lẫn nhau; không độc hại; sinh trƣởng tốt trong các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, thuận lợi cho việc sản xuất chế phẩm.
3.2.1.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza, tinh bột, protein
Từ 28 mẫu phân ủ, thức ăn và chất thải chăn nuôi, rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp, bã nấm, chúng tôi đã phân lập đƣợc 17 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza (xạ khuẩn:11; vi nấm: 2; vi khuẩn: 4), 12 chủng có khả năng phân giải tinh bột (5 chủng xạ khuẩn và 7 chủng vi khuẩn) và 6 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein. Kết quả đƣợc trình bày tại bảng 3.3.
Bảng 3.3. Số lƣợng chủng vi sinh vật phân lập
Nguồn phân lập VSV phân giải xenluloza VSV phân giải tinh bột VSV phân giải protein Số
mẫu Số chủng phân lập mẫu Số Số chủng phân lập mẫu Số Số chủng phân lập
Phân ủ 3 2 - - -
Chất thải chăn nuôi
8 5 8 4 8 2
Rác thải sinh hoạt 5 3 5 4 5 3
Rơm rạ, bã nấm 9 7 9 2 - - Thức ăn chăn nuôi ủ chua - - 3 2 3 1 Số mẫu 25 25 16 Tổng số chủng phân lập (35) 17 12 6 Số chủng có KT VPG≥ 20 mm 8 5 2
80
Để tuyển chọn chủng giống cho nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật xử lý nhanh chất thải chăn nuôi, các chủng đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể ở điều kiện thích hợp. Hoạt tính các chủng phân lập đƣợc đánh giá định tính bằng phƣơng pháp khuyếch tán enzym ngoại bào của dịch nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đĩa chứa cơ chất. Từ 35 chủng, sơ bộ sàng lọc đƣợc 15 chủng có khả năng sinh trƣởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định, bao gồm: 8 chủng phân giải xenluloza, 5 chủng phân giải tinh bột và 2 chủng phân giải protein; kích thƣớc vòng phân giải đều ≥ 20 mm. Đặc biệt, trong đó có các chủng đa hoạt tính; vừa phân giải xenluloza, vừa phân giải tinh bột hoặc vừa phân giải protein, vừa phân giải tinh bột. Kết quả đánh giá hoạt tính phân giải xenluloza, tinh bột, protein của các chủng vi sinh vật đƣợc trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng phân giải chất hữu cơ của các chủng vi sinh vật
Ký hiệu chủng Đƣờng kính vòng phân giải (D-d, mm)
Xenluloza (CMC) Tinh bột tan Protein (cazein)
TB7 28 - - XK47 29 - - XK112 34 20 - PT03 25 - - PT09 23 30 - BN5 22 29 - RT6 24 - - B75 - - 26 B15 - 21 30 B20 26 36 -
Chú thích (-): Không có vòng phân giải hoặc kích thước nhỏ, không rõ.
Trong số 8 chủng vi sinh vật phân giải xenluloza đƣợc tuyển chọn, chủng xạ khuẩn ký hiệu XK112 có khả năng phân giải xenluloza cao nhất (kích thƣớc vòng phân giải đạt 34 mm), đây là chủng ƣa nhiệt, có khả năng sinh trƣởng ở dải nhiệt độ rộng từ 35 đến 600C. Đặc biệt, ngoài khả năng tổng hợp xenlulaza, chủng XK112
81
còn có khả năng tổng hợp amylaza, vì vậy rất thích hợp để đƣa vào chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi.
Từ 5 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải tinh bột, lựa chọn đƣợc chủng vi khuẩn B20 có hoạt tính phân giải tinh bột mạnh nhất (kích thƣớc vòng phân giải đạt 34 mm), ngoài ra còn có khả năng tổng hợp xenlulaza nhƣng hoạt tính phân giải xenluloza không cao bằng chủng XK112.
Trong 2 chủng vi sinh vậtcó khả năng phân giải protein, chủng vi khuẩn B15 có hoạt tính phân giải protein mạnh nhất (kích thƣớc vòng phân giải đạt 30 mm) đồng thời cũng có khả năng phân giải tinh bột. Chủng vi khuẩn B15 sinh trƣởng tốt sau 48- 72 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt trên 109 CFU/ml.
3.2.1.2. Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có độ an toàn sinh học cao [46, 58], có khả năng sinh axit lactic, đƣợc ứng dụng nhiều trong bảo quản, chế biến thực phẩm, y học, dƣợc phẩm. Trong lĩnh vực nông nghiệp, vi khuẩn lactic mới chỉ đƣợc ứng dụng nhiều trong chế biến thức ăn chăn nuôi, xử lý nƣớc nuôi trồng thủy sản, xử lý mùi hôi thối trong chuồng nuôi gia súc, gia cầm. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy vi khuẩn lactic có khả năng sinh protein kháng khuẩn dạng bacterioxin, là tác nhân chính trong phòng chống sinh học các nguồn bệnh một cách an toàn, hiệu quả [79, 87, 92, 102, 112].
Nhằm tạo chế phẩm vi sinh vật có khả năng ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh, gây thối rữa, phát thải khí độc hại khi ủ phân gia súc, gia cầm, chúng tôi đã tiến hành phân lập, tuyển chọn các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn. Từ 22 mẫu đƣợc thu thập trên địa bàn thành phố Hà Nội gồm: 10 mẫu sản phẩm lên men truyền thống (nƣớc hoa quả lên men, dƣa, cà muối, thịt muối, nem chua); 4 mẫu chất thải chăn nuôi; 8 mẫu phụ phẩm chế biến thực phẩm (rỉ đƣờng, bã ép hoa quả, thức ăn chăn nuôi ủ chua...), đã phân lập đƣợc 7 chủng vi khuẩnlactic. Sau khi tách và làm thuần trên môi trƣờng thạch đĩa MRS có bổ sung 0,5% CaCO3, vi khuẩnlactic đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể để xác định
82
khả năng sinh trƣởng và hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn gây thối Erwinia carotovora KT03. Kết quả trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả phân lập vi khuẩn lactic
Ký hiệu
chủng Khả năng tạo vòng phân giải CaCO3 Mật độ tế bào sau 48 giờ (x 108 CFU/ml) pH sau 48 giờ nuôi cấy
La 02 ++ 5,4 4,2- 4,5 La 05 ++ 20,0 4,3- 4,5 La 07 + 10,4 4,3- 4,5 LH19 +++ 26,2 4,0- 4,2 LH17 +++ 62,0 3,8- 4,0 LH15 +++ 16,0 4,2- 4,3 LH11 +++ 11,6 4,0- 4,2
Để xác định yếu tố kháng khuẩn của vi khuẩn lactic là do axit lactic hay do peptid kháng khuẩn, tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy trƣớc và sau trung hoà pH và xử lý bằng enzym proteaza. Sau khi trung hoà pH, dịch nuôi cấy của một số chủng vẫn có hoạt tính kháng khuẩn nhƣng khi ly tâm và xử lý bằng enzym proteaza thì lại không xuất hiện vòng vô khuẩn hoặc kích thƣớc vòng vô khuẩn giảm. Có thể vòng vô khuẩn trƣớc khi trung hoà dịch nuôi cấy là do peptid kháng khuẩn nhƣng sau khi sử lý enzym thì protein đã bị phân huỷ. Thực tế cho thấy ở trong môi trƣờng axit nhẹ, hoạt tính bacterioxin thể hiện mạnh hơn trong môi trƣờng kiềm nhẹ. Cho đến nay các chất kháng khuẩn nguồn gốc từ vi khuẩn lactic đều thuộc nhóm bacterioxin, do vậy dịch nuôi cấy thô đƣợc dùng để xác định nhanh khả năng kháng khuẩn và sàng lọc nhanh chủng có hoạt tính sinh học cao. Sau khi phân lập, các chủng đƣợc nuôi cấy 48 giờ trên môi trƣờng dịch thể MRS, xác định khả năng sinh axit lactic và hoạt tính đối kháng E. carotovora KT03 của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc.
Tất cả 7 chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm đều có khả năng sinh axit lactic (chủng thấp nhất đạt 12,14 mg/ml đƣợc phân lập từ nem chua, chủng phân lập từ rỉ đƣờng lên men có hàm lƣợng axit lactic cao nhất, đạt 31,06 mg/ml). Mặc dù ở mức
83
độ khác nhau nhƣng dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic đều có vòng ức chế đối với E. carotovora KT03, kích thƣớc vòng ức chế cao nhất đạt 22 mm; thấp nhất là 12 mm. Tuy nhiên, không có mối quan hệ tỉ lệ thuận tuyệt đối giữa hàm lƣợng axit lactic với kích thƣớc vòng vô khuẩn. Chủng vi khuẩn có hàm lƣợng axit lactic cao nhất (31,06 mg/ml) lại có vòng vô khuẩn là 16 mm, thấp hơn so với chủng có hàm lƣợng axit lactic thấp nhất (12,14 mg/ml) với kích thƣớc vòng vô khuẩn 17 mm. Điều đó chứng tỏ hầu hết các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp axit lactic đều có khả năng ức chế E. carotovora KT03, nhƣng khả năng đối kháng là do tác động tổng hợp, vừa của axit lactic vừa của peptit kháng khuẩn. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
Ký hiệu chủng Hàm lƣợng axit lactic (mg/ml) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (D-d, mm) La 02 15,05 21 La 05 13,82 16 La 07 12,14 17 LH19 27,90 22 LH17 31,06 16 LH15 22,32 17 LH11 16,10 12
Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng phân lập từ sản phẩm muối chua truyền thống (dƣa chua) ký hiệu LH19 không những có khả năng sinh trƣởng tốt mà còn có kích thƣớc vòng ức chế cao nhất. Vì vậy, chủng LH19 đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Với mục tiêu bổ sung một tổ hợp các chủng vi sinh vật có chức năng khác nhau trong vai trò vi sinh vật khởi động cho quá trình xử lý chất thải chăn nuôi nên cần thiết phải đánh giá khả năng ức chế chéo giữa các chủng. Kết quả thử nghiệm cấy vạch trên môi trƣờng thạch đĩa cho thấy 4 chủng LH19, XK112, B20 và B15 không ức chế lẫn nhau.
84
Căn cứ vào kết quả đánh giá ban đầu đã tuyển chọn đƣợc bộ chủng giống vi sinh vật cho nghiên cứu, gồm 4 chủng đƣợc trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
Kí hiệu
chủng Đƣờng kính vòng phân giải (D-d, mm) Hàm lƣợng axit lactic (mg/ml)
Đƣờng kính vòng vô khuẩn đối với E. carotovora KT03
(D-d, mm) Xenluloza Tinh bột Protein
XK112 34 20 - - -
B20 26 38 - - -
B15 - 21 30 - -
LH19 27,9 22
Hình 3.2. Hoạt tính phân giải xenluloza của chủng xạ khuẩn XK112
Hình 3.3. Hoạt tính phân giải tinh bột của chủng vi khuẩn B20
Hình 3.4. Hoạt tính phân giải protein
của chủng vi khuẩn B15 Hình 3.5. Hoạt tính kháng KT03 của chủng vi khuẩn LH19 E. carotovora
3.2.2. Định tên và xác định độ an toàn sinh học của các chủng nghiên cứu
Sử dụng các chủng vi sinh vật vào sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi có nghĩa là đƣa các vi sinh vật sống vào môi trƣờng. Để quản lý và kiểm soát
85
đƣợc chất lƣợng, độ an toàn của các chế phẩm áp dụng trong thực tế sản xuất thì các chế phẩm phải có nguồn gốc, lý lịch chủng giống rõ ràng.
3.2.2.1. Định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống
Phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và định danh theo khoá phân loại của Bergey. Bốn chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có pH, nhiệt độ và thời gian thích hợp cho từng chủng, quan sát hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch đĩa và khả năng sinh trƣởng, các đặc điểm sinh hoá trong môi trƣờng dịch thể. Hình dạng, kích thƣớc tế bào của 4 chủng đƣợc xác định trên kính hiển vi điện tử quét với sự hỗ trợ thiết bị và kỹ thuật của Phòng Kính hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW.
* Chủng xạ khuẩn XK112
Chủng xạ khuẩn XK112 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gauze ở nhiệt độ 35- 370C. Sau 72 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc có hình tròn, bề mặt khô, nhăn, đƣờng kính 2- 2,5 mm, màu trắng xám, chân khuẩn lạc bám sâu vào môi trƣờng thạch.
Trong môi trƣờng dịch thể lắc sau 72 giờ, chủng xạ khuẩn XK112 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤ 1 mm, làm trong môi trƣờng nuôi cấy, tạo váng màu trắng bám vào thành bình, mật độ tế bào đạt 2,6 x 109 CFU/ml. Sau khi nuôi tĩnh 72- 96 giờ, mật độ tế bào đạt 4,2 x 106 CFU/ml, dịch thể phía dƣới ở dạng huyền phù, tạo các hạt tròn nhỏ, phía trên trong hơn, bề mặt môi trƣờng không đóng váng. Chủng XK112 sinh trƣởng và phân nhánh tạo thành hệ khuẩn ty. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét cho thấy chuỗi bào tử dạng thẳng, mỗi chuỗi có từ 15 đến 35 bào tử.
86 * Chủng vi khuẩn B20
Chủng B20 thuộc vi khuẩn Gram (+), hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Trên môi trƣờng King B ở nhiệt độ 300C, sau 48 giờ khuẩn lạc khô, màu nâu nhạt, hình dạng không tròn đều, mép có thùy, có đƣờng kính 0,5-1 mm.
Hình 3.7. Hình dạng tế bào của chủng vi khuẩn B20
Trên môi trƣờng dịch thể lắc, sau 48 giờ chủng B20 sinh trƣởng làm môi trƣờng nuôi chuyển sang màu vàng nhạt, trên thành bình tạo vòng váng màu nâu nhạt. Mật độ tế bào sau 48 giờ nuôi cấy đạt 4,6 x 109 CFU/ml. Trong điều kiện nuôi tĩnh, sau 48-72 giờ chủng B20 sinh trƣởng làm đục môi trƣờng dịch thể, bề mặt môi trƣờng đóng váng, mật độ tế bào đạt 1,2 x 108 CFU/ml. Tế bào chủng B20 hình que, ngắn, kích thƣớc 5,2 x 0,8 m. Tạo bào tử hình ovan.
* Chủng vi khuẩn B15
Chủng vi khuẩn B15 thuộc thuộc nhóm hiếu khí không bắt buộc, Gram (+). Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng King B, nhiệt độ 300C, khuẩn lạc khô, màu vàng nhạt, lan trên mặt thạch, bề mặt khô nhăn, lồi ở tâm hoặc tạo lớp màng, mép xẻ thùy, có đƣờng kính 0,7-1 mm.
Trong môi trƣờng dịch thể, sau 48 giờ chủng vi khuẩn B20 sinh trƣởng làm môi trƣờng nuôi cấy chuyển màu vàng nhạt, trên thành bình tạo vòng váng màu nâu nhạt. Mật độ tế bào lắc sau 48 giờ nuôi đạt 5,4 x 109 CFU/ml. Trong điều kiện nuôi tĩnh, sau 48-72 giờ chủng vi khuẩn B20 sinh trƣởng làm đục môi trƣờng dịch thể, bề mặt môi trƣờng đóng váng, mật độ tế bào đạt 4,2 x 106 CFU/ml.
87
Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét cho thấy tế bào hình que nhỏ, đứng riêng rẽ kích thƣớc 444 nm x 2,02 m, bào tử hình bầu dục.
Hình 3.8. Hình dạng, kích thƣớc tế bào của chủng vi khuẩn B15 * Chủng vi khuẩn LH19
Nuôi trên môi trƣờng MRS ở 32-350C sau 48 giờ, khuẩn lạc của chủng vi khuẩn LH19 có hình dạng tròn nhỏ, màu trắng sữa, bề mặt mịn, tạo vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch MRS bổ sung 0,5% CaCO3. Chủng vi khuẩn LH19 không di động, không sinh bào tử, bắt màu Gram (+), thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét cho thấy tế bào hình que, đứng riêng rẽ, kích thƣớc 514 nm 2,44 m.
88
Hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch đĩa của 4 chủng vi sinh vật nghiên cứu đƣợc thể hiện trên các hình từ 3.10 đến 3.13.
Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XK112
Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn B20
Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc
của chủng vi khuẩn B15 Hình 3.13. Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn LH19 Song song với việc đánh giá đặc điểm về hình thái, thử nghiệm khả năng đồng hoá các nguồn hydratcacbon, thuỷ phân cazein, gelatin và một số phản ứng cần thiết khác cũng đƣợc tiến hành để xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi sinh vật. Kết quả trong bảng 3.8 cho thấy:
- Chủng xạ khuẩn XK112 sử dụng đƣợc nguồn hydratcacbon khá đa dạng, ngoài các loại đƣờng, chủng XK112 vừa có khả năng phân giải CMC vừa có khả năng thuỷ phân tinh bột.
- Chủng vi khuẩn B20 có khả năng đồng hoá tốt với tất cả 4 nguồn đƣờng đặc trƣng