* Trong bảo quản, chế biến thực phẩm
Bacterioxin, đặc biệt là các bacterioxin từ vi khuẩn lactic có nhiều đặc tính thích hợp, đáp ứng đƣợc các yêu cầu của chất bảo quản thực phẩm lâu dài nhƣ là: các hợp chất an toàn, không hoạt động và không gây độc trên tế bào ngƣời, dễ dàng bị bất hoạt bởi các proteaza trong hệ tiêu hóa, rất ít ảnh hƣởng tới hệ vi khuẩn đƣờng ruột, bền nhiệt và ổn định trong các pH, có phổ kháng khuẩn khá rộng đối với nhóm các vi khuẩn gây ngộ độc và hƣ hỏng thực phẩm [11, 46, 58, 102, 105].
Ngày nay, ngƣời tiêu dùng rất quan tâm tới những ảnh hƣởng của các chất phụ gia hoá học có trong thực phẩm đến sức khoẻ con ngƣời. Xu hƣớng hiện tại là tìm đến các sản phẩm sạch, có nguồn gốc từ thiên nhiên. Sử dụng bacterioxin trong bảo quản thực phẩm có thể mang lại nhiều lợi ích: tăng thời hạn sử dụng của thực phẩm, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do
55
hƣ hỏng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng nhƣ giảm bớt nhiệt độ và áp suất trong quá trình xử lý, thích hợp trong công nghệ đóng hộp hoa quả, thực phẩm vì bảo đảm đƣợc giá trị dinh dƣỡng nhất là hàm lƣợng vitamin, hƣơng vị và màu sắc tự nhiên của thực phẩm [86, 92, 94, 102, 112].
Thịt lên men đã đƣợc dùng phổ biến từ xa xƣa ở khắp thế giới, trong đó có các loại xúc xích lên men bán khô (semidry sausage), để sản xuất, ngƣời ta thƣờng dùng các vi khuẩn lactic nhƣ L. plantarum [58, 113], L. pentosus, L. sake, L. curvatus, L. pentosaceus, L. acidilactis... với chức năng axit hóa, chống oxi hóa, đặc biệt là sinh tổng hợp bacterioxin để tránh nhiễm trùng, đảm bảo đƣợc chất lƣợng và vệ sinh an toàn thực phẩm, nhiều loài còn tạo hƣơng thơm đặc trƣng cho rƣợu vang, bia, phomat, các sản phẩm sữa [5, 86, 92].
Todorov và cộng sự [121] đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của chủng L. plantarum ST13BR, một chủng đƣợc phân lập từ bia (kích thƣớc phân tử 10k Da) ức chế sinh trƣởng của vi khuẩn Lactobacillus casei, P. aeruginosa, E. faecalis, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli. Nghiên cứu đã tìm đƣợc các loại môi trƣờng có ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp bacterioxin và hỗn hợp các loại môi trƣờng mà việc sinh tổng hợp bacterioxin là lớn nhất.
Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc các loại môi trƣờng, nhiệt độ và pH có ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp bacterioxin và thành phần các loại môi trƣờng (sữa đậu nành, giá đỗ và mật đƣờng tƣơng tự nhƣ trên môi trƣờng MRS) mà việc sinh tổng hợp bacterioxin là lớn nhất đƣợc ghi nhận sau 24h nuôi cấy [5, 8, 11, 13, 26, 28, 66, 87, 117]. Các nghiên cứu tuyển chọn chủng, gây đột biến, tái tổ hợp đã tạo ra các bacterioxin hoạt tính cao, phổ kháng khuẩn rộng có tác dụng chống lại hơn 150 loại vi khuẩn thƣờng gặp [13, 66, 94].
* Trong y tế và chăm sóc sức khỏe
Một trong những hạn chế của việc sử dụng các chất kháng sinh phổ rộng là tiêu diệt hầu hết các loài vi khuẩn không kháng thuốc. Vì vậy, hiện tƣợng kháng đa thuốc đang ngày càng lan rộng trong các quần thể vi khuẩn gây bệnh do sự mất cân bằng của quần thể các vi sinh vật hội sinh. Với phổ kháng khuẩn hẹp, tính đặc hiệu
56
tế bào đích cao, bacterioxin đƣợc xem là các “dƣợc phẩm thiết kế” (designer drugs), là giải pháp cho những thách thức để kiểm soát các bệnh nhiễm trùng hiện nay [11, 13, 45, 103, 105].
Các vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng nhƣ một phƣơng pháp sinh học nhằm bình thƣờng hóa hệ vi khuẩn ở ruột. Hỗn hợp vi khuẩn sinh lactic (L. acidophilus, B. longum, E. faecalis) đƣợc bào chế dƣới dạng vi nang (microencapsulated) đảm bảo cho vi khuẩn lactic không bị ảnh hƣởng bởi nhiệt độ và oxy không khí, tránh tác động của dịch vị dạ dày.
Vi khuẩn lactic ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh
Staphylococcus, Shigella, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella và E. coli
bằng cách sinh ra axit lactic, axit béo, peroxit và sinh tổng hợp các bacterioxin: lactacin, lactacin F, acidophilucin A, acidophilin có tác động trên cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). B. bifidum sinh bifidin có phổ kháng khuẩn rộng và bền với nhiệt độ [45, 50, 58].
Farida Khalid và cs [121] đã nghiên cứu một loại bacterioxin mới có tên lactocin LC-09, đƣợc phân lập từ Lactobacillus trong một mẫu bệnh. Loại này ức chế một số loại Lactobacillus và vi khuẩn Gram (+) khác nhƣ Listeria ivanovii, Streptococcus agalactii và S. pyogenes. Lactocin LC-09 chịu nhiệt (4 giờ ở 100oC) và thích hợp với môi trƣờng có pH axit. Bacterioxin này bị khử hoạt tính bởi proteaza, có thể dùng acridin orang, ethidium bromit để gây đột biến trong việc sản sinh ra loại bacterioxin phục vụ cho y học.
* Trong nông nghiệp
- Trong nuôi trồng thủy sản, vi khuẩn lactic sinh bacterioxin đƣợc sử dụng để xử lý nƣớc, tăng sức đề kháng, phòng bệnh cho tôm. Đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm sử dụng bacterioxin giúp tăng tốc độ sinh trƣởng, tăng khả năng phân hủy xenluloza, kiểm soát một số vi sinh vật gây bệnh (E. coli, Salmonella). Bacterioxin còn bị phân hủy nhanh trong cơ thể động vật, vì vậy không để lại dƣ lƣợng trong thịt [18, 72, 103, 104, 105].
57
- Trong trồng trọt: Trong quá trình sống, nhiều vi khuẩn đã tiết ra chất kháng khuẩn nhằm cạnh tranh không gian sống và nguồn dinh dƣỡng. Dựa trên đặc điểm này, các nhà khoa học đã nghiên cứu phƣơng pháp kiểm soát bệnh cây, bằng cách sử dụng các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh cây trồng.
Các nhà khoa học đã nghiên cứu vi khuẩn lactic phân lập từ nhiều môi trƣờng khác nhau và thấy rằng 10% các chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế
Aspergillus fumigatus và 4% tiết ra chất kháng khuẩn có hoạt tính kháng loại mốc này rất mạnh [72, 104, 105]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn lactic còn đƣợc ứng dụng hiệu quả trong ngăn ngừa hoạt động và lan truyền của các vi nấm gây bệnh cho cây trồng nhƣ Fusarium, Aspergillus niger, Colletotrichum, gây bệnh thối cổ rễ, bệnh héo vàng cây họ đậu, cà phê, hồ tiêu và ức chế vi khuẩn gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn [8, 72, 103, 104, 105].
- Vi khuẩn lactic còn đƣợc ứng dụng trong xử lý chất thải chăn nuôi, để khử mùi hôi chuồng trại, xử lý các nguồn chất thải hữu cơ làm phân bón cho cây trồng dƣới dạng các chế phẩm EM thứ cấp, EM Bokach, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng và phát triển nông nghiệp bền vững [9, 10, 18, 27, 72].
58
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Các mẫu thu thập và chủng vi sinh vật 2.1.1.1. Mẫu thu thập 2.1.1.1. Mẫu thu thập
50 mẫu nghiên cứu đƣợc thu thập trên địa bàn Hà Nội, Nghệ An, Đăklac gồm: 10 mẫu thực phẩm và sản phẩm lên men truyền thống(nƣớc hoa quả lên men, dƣa, cà muối, thịt muối, nem chua), 12 mẫu chất thải chăn nuôi, 11 mẫu phụ phẩm chế biến thực phẩm (rỉ đƣờng, bã ép hoa quả, bã đậu ủ chua làm thức ăn chăn nuôi), 17 mẫu phân ủ, rác thải sinh hoạt, phế phụ phẩm nông nghiệp (rơm rạ, bã nấm).
2.1.1.2. Vi sinh vật
- Vi sinh vật chỉ thị đƣợc dùng để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic gồm:
+ Các VK cùng họ với VK lactic: L. agilis JCM 1230, L. salivarius JCM 5804, L. plantarum JCM 1048 và JCM1149, Leuconostos mesenteroides,L. fermentum, Streptococcus sppdo Phòng Công nghệ Vật liệu Sinh học- Viện CNSH cung cấp. + Chủng vi khuẩn gây bệnh thối ƣớt khoai tây Erwinia carotovora KT03 do Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp.
+ Các chủng VSV gây bệnh cho ngƣời và vật nuôi: E. coli PA2, E. coli NC, Salmonella spp, Shigella flexneri, E. faecalis, S. aureus ATCC 29213 do Phòng Vi khuẩn hiếm gặp- Viện Vệ sinh Dịch tễ TW và Viện CNSH cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, CH3COONa, agar, tricin, dextroza, trypsin, α- chymotrysin, proteinaza K, Coomasie Briliant Blue-G250 (Merk, Đức); MgSO4; MgCl2, CaCl2, NaOH, NaCl, axetát kali, axit axêtic, sunphat amôn, glucoza, bộ kit tinh sạch ADN (Qiagen, Đức), SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức), glycerol, agaroza, polyacrylamit, triton X-100, lysozym (Gribco, Mỹ), cao nấm men, pepton, Deoxynucleosit triphosphat (Sigma, Mỹ), carboxymethyl celluloza (Sigma, Mỹ)...
59
2.1.3. Các dung dịch và môi trƣờng 2.1.3.1. Các dung dịch
* Các dung dịch dùng cho tách chiết và điện di ADN
+ Dung dịch I (Sol I): Tris-HCl 25 mM, pH 8, EDTA 10 mM, pH 8, glucoza 50 mM. Dung dịch II (Sol II): NaOH 0,2%; SDS 1%. Dung dịch III (Sol III): kali axêtát 3 M, axit axêtic 5 M.
+ Dung dịch đệm SCED: sorbitol 1 M, xitrat natri 10 mM pH7,5, EDTA 10 mM, DTT 10 mM.
+ Dung dịch đệm TE: Tris HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, pH 8. + Dung dịch chlorofom/isoamylalcohol (24:1).
+ Dung dịch phenol/chlorofom/isoamylalcohol (25:24:1).
+ Dung dịch đệm TAE 50 lần (50X - 100 ml): Tris 24,2%; axit axêtic: 5,71 ml, EDTA 0,5M pH 8: 10 ml.
+ Đệm tra mẫu (loading dye 6X): Bromophenol blue 0,25%, xylen cyanol FF 0,25%, glycerol 30%.
+ Dung dịch nhuộm gel: ethidium fromua (EtBr) 0,5 g/ml. * Các dung dịch dùng trong điện di protein Tricine-SDS-PAGE
Điện di Tricine-SDS-PAGE đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Schangger [108] bằng các hóa chất và dung dịch sau:
+ Dung dịch acrylamit-bisacrylamit (AB)-3: hòa tan 48 g acrylamit và 1,5 g bisacrylamit (Serva) trong 100 ml nƣớc cất vô trùng, bảo quản ở 7-10o C.
+ Đệm gel (Gel buffer 3X): Tris 3 M, HCl 1 M, SDS 0,3%, chỉnh pH đến 8,45, glycerol, APS 10%, TEMED.
+ Đệm xử lý mẫu (treatment buffer 4X): SDS 12%, mercaptoethanol 6%, glycerol 30%, Coomassie brillliant blue G-250 0,05%, Tris/HCl (pH 7,0) 150 mM.
+ Đệm chạy điện di cực dƣơng: Tris 0,1 M, HCl 0,0225 M, điều chỉnh pH đến 8,9. + Đệm chạy cực âm: Tris 0,1 M, Tricine 0,1 M, SDS 0,1%, chỉnh pH đến 8,25.
Dung dịch dùng trong cố định gel (fixing solution- dùng cho nhuộm bạc và coomassie): metanol 50%, axit axêtic 10%, axetát amon 100 mM.
60
- Dung dịch nhuộm gel (Coomassie brilliant blue G- CBB): CBB G-250 0,025%; axit axêtic 10%.
- Dung dịch rửa gel: axit axêtic 10%
- Các dung dịch dùng trong nhuộm bạc: Dung dịch Sensitize: thiosunphat natri 0,005%; Dung dịch bạc: nitrát bạc 0,1%; Dung dịch hiện màu: cacbonat natri 2%; formaldehyt 0,036%; Dung dịch dừng phản ứng: EDTA 50 mM.
Các thành phần của gel Tricine-SDS:
Hóa chất Đơn vị Gel 4% Gel 10% Gel 16%
AB-3 ml 1 6 10 Gel buffer (3X) ml 3 10 10 Glycerol g - 3 3 H20 ml 12 30 30 APS (10%) l 90 150 100 TEMED l 9 15 10 2.1.3.2. Môi trƣờng + Gause Tinh bột tan: 20 g KH2PO4: 0,5 g MgSO4 .7H2O: 0,5 g KNO3 :1 g NaCl : 0,5 g FeSO4 : 0,01 g Nƣớc cất:1000 ml pH: 7,0 + King B Pepton: 20 g Glyxerin: 10 g MgSO4.7H2O: 0,5 g K2HPO4: 1 g + MRS Glucoza: 20 g K2HPO4: 2 g Cao thịt: 1 g Pepton: 10 g Cao nấm men: 4 g CH3COONa: 5 g Triamoni xitrat: 2 g MgSO4.7H2O: 0,2 g MnSO4.4H2O : 0,05 g Tween 80: 1 ml Nƣớc cất: 1000 ml pH: 6,5 + MT sản xuất 1: Rỉ đƣờng: 20 g Cao nấm men: 10 g K2HPO4: 0,2 g Nƣớc sạch: 1.000 ml pH: 6,8- 7,0 + MT sản xuất 2: Nƣớc chiết giá: 40 ml Glucoza:5g Cao nấm men: 5 g Nƣớc sạch: 1000 ml pH: 6,8- 7,0 + MT sản xuất 3: Pepton : 10 g
61 Nƣớc cất: 1000 ml pH: 6,8- 7,0 + Macconkey Macconkey aga : 51,5 g Nƣớc cất: 1000 ml pH = 7,1± 0,2 + SS agar SS aga : 60,0 g Nƣớc cất : 1000 ml pH = 6,8-7,2. + NA Cao thịt bò: 3 g Pepton : 3 g Nƣớc cất: 1000 ml pH: 7,2 + PDA
Nƣớc chiết khoai tây : 200 ml Dextrin: 20 g Nƣớc cất: 800 ml; pH: 6,8. Cao nấm men: 10 g Glucoza: 1 g Nƣớc sạch: 1000 ml pH: 6,8- 7,0 * Môi trƣờng đặc bổ sung aga: 15-20 g/l, khử trùng môi trƣờng ở 121oC/15 phút. 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ
Kính hiển vi điện tử quét Fe-SEM, cân điện tử, bộ chia môi trƣờng (Hitachi, Nhật), tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ), máy ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorvall RC5B, Mỹ), thiết bị lấy mẫu khí SKC Universal PCXR4, máy đo DR2500 (HACH-Mỹ); máy đo pH (Metler, Thụy Sỹ), máy biến tính mẫu, bộ chuyển màng (Bio-Rad, Mỹ), máy Gen Amp PCR System 9700 (ABI, Mỹ), máy Sequencer ABM Prism 3100-Avant (ABI, Mỹ), máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy ly tâm Eppendorf, bộ điện di đứng và ngang (Bio-Rad, Mỹ), máy biến nạp bằng xung điện, bộ kit tinh sạch ADN từ gel agaroza, máy Speed-Vac, máy điện di protein (Bio-Rad, Mỹ)…
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Phƣơng pháp phân loại
2.2.1.1. Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống:
Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá và khoá phân loại của Bergey [69, 70, 83, 84, 110]
* Xác định đặc điểm hình thái, sinh hoá: Đặc điểm khuẩn lạc, khả năng hình thành bào tử, phản ứng catalaza, nhu cầu ôxy, các đặc điểm sinh hoá đƣợc thực hiện theo các phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học thông thƣờng. Hình ảnh tế bào
62 đƣợc quan sát trên kính hiển vi điện tử quét.
* Xác định khả năng đồng hoá các nguồn hydratcacbon: Nuôi cấy trong môi trƣờng cơ bản đặc hiệu với từng chủng (dạng dịch thể) ở điều kiện thích hợp, thay thế các nguồn hydratcacbon khác nhau. Dựa vào sự chuyển biến màu của dịch nuôi cấy để đánh giá phản ứng dƣơng tính hay âm tính.
2.2.1.2. Phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Là phƣơng pháp phân loại dựa trên giải trình tự gien ADNr 16S. Xác định trình tự ADNr 16S của các chủng vi khuẩn theo phƣơng pháp của Sakiyama và cs năm 2009 [106].
* Tách chiết ADN
- Nguyên tắc: Thành tế bào của VSV đƣợc phá vỡ bởi lyzozim và các chất tẩy mạnh nhƣ SDS - Tris - HCl giúp ADN đƣợc giải phóng. Protein và ARN đƣợc tách ra khỏi ADN nhờ các enzym xúc tác RNazaA, proteaza K và các dung môi Chlorofom: isoamyl alcohol (24:1). Cuối cùng ADN đƣợc tủa bằng etanol (-220C) tuyệt đối và xác định nồng độ ADN trong dịch mẫu.
- Tiến hành: ADN đƣợc chiết xuất và tách từ sinh khối ƣớt + Ly tâm 1.5 ml dịch nuôi vi khuẩn để lấy sinh khối tế bào.
+ Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE ( đệm TE: 15 mM Tris-HCl +1 mM EDTA pH 7,5).
+ Thêm 0,4 mg lyzozim. Trộn đều, ủ 370C/1 giờ. Trộn đều 3 phút.
+ Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 370C/30 phút. + Thêm một thể tích tƣơng đƣơng phenol: clorofom: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 13000 v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.
+ Thêm 8 l ARNaza 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút. + Thêm 12 l proteinaza K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 560C.
+ Thêm một thể tích tƣơng đƣơng phenol: clorofom: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 13000 v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.
63
+ Thêm 1 thể tích tƣơng đƣơng clorofom: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 13000 v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.
+ Thêm 1/ 10 thể tích natri axetat 3M và 1ml etanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút. Ly tâm 13000 v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên.
+ Rửa tủa bằng etanol 70%.
+ Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không. + Hoà tan ADN trong 50-100 l nƣớc hoặc TE.
* Phản ứng khuếch đại ADN (PCR)
- Nguyên tắc: Phƣơng pháp này sử dụng ADN polymeraza và các oligonucleotit
tổng hợp nhân tạo, một đoạn ADN dùng làm khuôn đƣợc nhân lên nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỷ lần mà không cần đến nhiều tế bào vi khuẩn.
- Tiến hành: + Thành phần phản ứng: Thành phần Thể tích (l) Đệm 10X 10 MgCl2 8 dNTP 2,0 mM 10
Mồi xuôi (10 pmol/l) 2 Mồi ngƣợc (10 pmol/l) 2 Taq polymeraza 2 Template ( khuôn) 1-2 H2O cho đủ 100 + Chu trình nhiệt: 960C - 3 phút 960C - 45giây 550C - 30 giây 35 chu kỳ 720C - 2 phút 720C - 7 phút 40C -
64
+ Primer cặp mồi:
Mồi xuôi : 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. Mồi ngƣợc: 1525R 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'
- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di
Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2 ml, nƣớc cất: 98 ml, agaroza: 1 g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300 ml dung dịch 1 X TAE, trộn 2 l dung dịch 6X với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng, chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.
* Tinh sạch sản phẩm PCR