Theo số liệu điều tra, các chỉ số về ô nhiễm môi trƣờng chăn nuôi phụ thuộc nhiều vào thời gian vệ sinh chuồng trại, phƣơng pháp, tần xuất thu gom, quản lý và sử dụng nguồn chất thải. Một số trang trại quy mô lớn đƣợc đầu tƣ thiết kế chuồng trại tốt hơn trang trại vừa và nhỏ nên thuận lợi cho việc vệ sinh, thu gom chất thải, đồng thời có nhà chứa chất thải nên hạn chế đƣợc tác động của mƣa, nắng đến lƣợng chất thải thu gom. Có khoảng 80% trang trại qui mô nhỏ không xử lý chất thải khi thu gom, khối lƣợng chất thải tồn đọng càng lớn thì mật độ khí thải và nguy cơ lan truyền nguồn bệnh càng cao. Một số ít trang trại ủ đống phế thải trong vòng 1 tuần, trƣớc khi chuyển ra ngoài khu vực chăn nuôi. Phần lớn các bao tải dùng trong quá trình thu gom, vận chuyển chất thải đƣợc tái sử dụng nhiều lần, không đƣợc vệ sinh tiêu độc nên nguy cơ gây ô nhiễm môi trƣờng và lây lan nguồn bệnh là rất cao.
3.1.2.1. Ô nhiễm do khí thải độc hại
Hầu hết các cơ sở chăn nuôi lợn, gà đƣợc điều tra trong nghiên cứu đều tiến hành dọn vệ sinh chuồng trại định kỳ với các hoá chất khử trùng phổ biến nhƣ Han Iodil, Ben cocid, BKA, cloramin, allside dạng phun sƣơng hoặc pha loãng theo nồng độ quy định. Mặc dù vậy, các biện pháp này chỉ có hiệu lực khử trùng và giảm mùi hôi thối trong thời gian nhất định ở khu vực chuồng trại, chƣa giải quyết đƣợc
77
tận gốc nguồn sinh khí thải (NH3, H2S). Các vi khuẩn gây thối, vi sinh vật gây bệnh vẫn tồn tại trong chất thải chăn nuôi và phát thải khí ra môi trƣờng xung quanh.
Bảng 3.1. Môi trƣờng không khí tại các trang trại chăn nuôi
TT Nơi đánh giá Chỉ tiêu đánh giá
Độ nhiễm khuẩn không khí (CFU/m3) Nồng độ H2S (mg/m3) Nồng độ NH3 (mg/m3) 1 Khu tập kết chất thải nuôi lợn 5,8 ± 0,45 x 106 0,36 ± 0,05 (4,5a) 3,12 ± 0,06 (15,6b) 2 Khu tập kết chất thải nuôi gà 7,2 ± 0,38 x 106 0,32 ± 0,04 (4a) 2,94 ± 0,08 (14,7b)
3 Giới hạn tối đa 106 0,08 * 0,2 **
(*): Theo TCVN 5937/95; (**): Theo TCVN 5938/95;
a, b: số lần tăng so với giới hạn cho phép tại trang trại chăn nuôi
Số liệu trung bình của các trang trại điều tra đƣợc nêu tại bảng 3.1 cho thấy độ nhiễm khuẩn không khí cao hơn từ 6-7 lần so với giới hạn cho phép. Nồng độ H2S tại khu vực tập kết chất thải nuôi lợn là 0,36 mg/m3, cao gấp 4,5 lần so với giới hạn và cao hơn so với khu vực tập kết chất thải nuôi gà (0,32 mg/m3, cao gấp 4 lần). Nồng độ NH3 ở khu vực tập kết chất thải nuôi lợn và gà ở mức 3,12 và 2,94 mg/m3 (cao hơn mức giới hạn khoảng 15 lần).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Viện Chăn nuôi năm 2010 [27] và thấp hơn so với báo cáo của Cục Chăn nuôi về ô nhiễm môi trƣờng tại các trại chăn nuôi gia súc, gia cầm tập trung [3]. Theo báo cáo của Cục Chăn nuôi, số liệu điều tra năm 2005 cho thấy nồng độ H2S trong chuồng nuôi gà cao gấp 83,4 lần so với giới hạn và trong chuồng nuôi lợn gấp 64,4 lần; nồng độ NH3 trong chuồng nuôi gà cao gấp 30,6 lần so với giới hạn và trong chuồng nuôi lợn gấp 24,15 lần. Có sự chênh lệch kết quả do khác nhau về thời gian nghiên cứu, địa điểm lấy mẫu. Nghiên cứu của chúng tôi xác định nồng độ khí ở khu vực ngoài chuồng nuôi nơi tập kết chất thải nhằm đánh giá mức độ ô nhiễm do chất thải chăn nuôi để có các biện pháp xử lý nhằm hạn chế ô nhiễm trong quá trình thu gom, vận chuyển và sử dụng.
78
3.1.2.2. Ô nhiễm do vi sinh vật gây bệnh và ký sinh trùng
Song song với việc xác định nồng độ khí NH3, H2S, nghiên cứu cũng xác định mật độ tế bào E. coli, Salmonella spvà ký sinh trùng là những mầm bệnh đƣợc xem là chỉ thị cho mức độ ô nhiễm, lây lan nguồn bệnh cho con ngƣời và môi trƣờng. Mẫu chất thải đƣợc lấy khi thu gom, bảo quản ở 40C trƣớc khi phân tích.
Bảng 3.2. Mật độ vi sinh vật gây bệnh và ký sinh trùng trong chất thải chăn nuôi
TT Loại chất thải Mật độ tế bào VSV (CFU/g) Trứng giun/g
VKTS * E. coli Salmonella
1 Chất thải nuôi lợn 6,58±0,6 x 106 2,20±0,5x 105 1,2±0,2x 103 105± 4,8 2 Chất thải nuôi gà 7,10 ±0,4x 107 8,06±0,3x 105 2,4±0,1x 103 120± 3,5
3 Mức cho phép 104 (-)**
(*): Vi khuẩn tổng số ); (-)**: Không được có trong 25 g mẫu
Kết quả trong bảng 3.2 cho thấy: chất thải rắn chăn nuôi gà, lợn chứa quần thể vi sinh vật tổng số và ký sinh trùng khá cao. Mật độ E. coli cao hơn 20-80 lần giới hạn cho phép. Các mẫu chất thải chăn nuôi lợn và gà đều chứa Salmonella với mật độ lớn hơn 103 CFU/g, tuy nhiên theo qui định thì chất thải chăn nuôi sử dụng cho nông nghiệp không đƣợc chứa Salmonella trong 25 g mẫu. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cục Chăn nuôi, Viện Chăn nuôi và Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam [6, 10, 27, 30 , 31].
Nhƣ vậy chất thải chăn nuôi gà, lợn dạng rắn tiềm ẩn nguy cơ gây ô nhiễm môi trƣờng khá cao, cần phải đƣợc xử lý ô nhiễm trong quá trình thu gom, vận chuyển và trƣớc khi sử dụng trong trồng trọt hoặc nuôi trồng thuỷ sản.
3.2. NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI 3.2.1. Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật 3.2.1. Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật
Vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên. Muốn thúc đẩy nhanh quá trình xử lý chất thải chăn nuôi, ngoài việc đảm bảo các điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật sinh trƣởng cần
79
phải tuyển chọn, bổ sung các chủng vi sinh vật khởi động có hoạt tính sinh học cao để rút ngắn thời gian chuyển hóa, giảm thiểu ô nhiễm, nâng cao hiệu quả xử lý chất thải chăn nuôi. Mục tiêu của nghiên cứu là tuyển chọn các chủng vi sinh vật có các đặc điểm sau: có khả năng ức chế tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh và vi khuẩn sinh mùi hôi thối đồng thời phân giải nhanh chất hữu cơ; sinh trƣởng nhanh trong chất thải chăn nuôi, cạnh tranh với vi sinh vật tự nhiên trong chất thải song lại không ức chế lẫn nhau; không độc hại; sinh trƣởng tốt trong các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, thuận lợi cho việc sản xuất chế phẩm.
3.2.1.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza, tinh bột, protein
Từ 28 mẫu phân ủ, thức ăn và chất thải chăn nuôi, rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp, bã nấm, chúng tôi đã phân lập đƣợc 17 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza (xạ khuẩn:11; vi nấm: 2; vi khuẩn: 4), 12 chủng có khả năng phân giải tinh bột (5 chủng xạ khuẩn và 7 chủng vi khuẩn) và 6 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein. Kết quả đƣợc trình bày tại bảng 3.3.
Bảng 3.3. Số lƣợng chủng vi sinh vật phân lập
Nguồn phân lập VSV phân giải xenluloza VSV phân giải tinh bột VSV phân giải protein Số
mẫu Số chủng phân lập mẫu Số Số chủng phân lập mẫu Số Số chủng phân lập
Phân ủ 3 2 - - -
Chất thải chăn nuôi
8 5 8 4 8 2
Rác thải sinh hoạt 5 3 5 4 5 3
Rơm rạ, bã nấm 9 7 9 2 - - Thức ăn chăn nuôi ủ chua - - 3 2 3 1 Số mẫu 25 25 16 Tổng số chủng phân lập (35) 17 12 6 Số chủng có KT VPG≥ 20 mm 8 5 2
80
Để tuyển chọn chủng giống cho nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật xử lý nhanh chất thải chăn nuôi, các chủng đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể ở điều kiện thích hợp. Hoạt tính các chủng phân lập đƣợc đánh giá định tính bằng phƣơng pháp khuyếch tán enzym ngoại bào của dịch nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đĩa chứa cơ chất. Từ 35 chủng, sơ bộ sàng lọc đƣợc 15 chủng có khả năng sinh trƣởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định, bao gồm: 8 chủng phân giải xenluloza, 5 chủng phân giải tinh bột và 2 chủng phân giải protein; kích thƣớc vòng phân giải đều ≥ 20 mm. Đặc biệt, trong đó có các chủng đa hoạt tính; vừa phân giải xenluloza, vừa phân giải tinh bột hoặc vừa phân giải protein, vừa phân giải tinh bột. Kết quả đánh giá hoạt tính phân giải xenluloza, tinh bột, protein của các chủng vi sinh vật đƣợc trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng phân giải chất hữu cơ của các chủng vi sinh vật
Ký hiệu chủng Đƣờng kính vòng phân giải (D-d, mm)
Xenluloza (CMC) Tinh bột tan Protein (cazein)
TB7 28 - - XK47 29 - - XK112 34 20 - PT03 25 - - PT09 23 30 - BN5 22 29 - RT6 24 - - B75 - - 26 B15 - 21 30 B20 26 36 -
Chú thích (-): Không có vòng phân giải hoặc kích thước nhỏ, không rõ.
Trong số 8 chủng vi sinh vật phân giải xenluloza đƣợc tuyển chọn, chủng xạ khuẩn ký hiệu XK112 có khả năng phân giải xenluloza cao nhất (kích thƣớc vòng phân giải đạt 34 mm), đây là chủng ƣa nhiệt, có khả năng sinh trƣởng ở dải nhiệt độ rộng từ 35 đến 600C. Đặc biệt, ngoài khả năng tổng hợp xenlulaza, chủng XK112
81
còn có khả năng tổng hợp amylaza, vì vậy rất thích hợp để đƣa vào chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi.
Từ 5 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải tinh bột, lựa chọn đƣợc chủng vi khuẩn B20 có hoạt tính phân giải tinh bột mạnh nhất (kích thƣớc vòng phân giải đạt 34 mm), ngoài ra còn có khả năng tổng hợp xenlulaza nhƣng hoạt tính phân giải xenluloza không cao bằng chủng XK112.
Trong 2 chủng vi sinh vậtcó khả năng phân giải protein, chủng vi khuẩn B15 có hoạt tính phân giải protein mạnh nhất (kích thƣớc vòng phân giải đạt 30 mm) đồng thời cũng có khả năng phân giải tinh bột. Chủng vi khuẩn B15 sinh trƣởng tốt sau 48- 72 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt trên 109 CFU/ml.
3.2.1.2. Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có độ an toàn sinh học cao [46, 58], có khả năng sinh axit lactic, đƣợc ứng dụng nhiều trong bảo quản, chế biến thực phẩm, y học, dƣợc phẩm. Trong lĩnh vực nông nghiệp, vi khuẩn lactic mới chỉ đƣợc ứng dụng nhiều trong chế biến thức ăn chăn nuôi, xử lý nƣớc nuôi trồng thủy sản, xử lý mùi hôi thối trong chuồng nuôi gia súc, gia cầm. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy vi khuẩn lactic có khả năng sinh protein kháng khuẩn dạng bacterioxin, là tác nhân chính trong phòng chống sinh học các nguồn bệnh một cách an toàn, hiệu quả [79, 87, 92, 102, 112].
Nhằm tạo chế phẩm vi sinh vật có khả năng ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh, gây thối rữa, phát thải khí độc hại khi ủ phân gia súc, gia cầm, chúng tôi đã tiến hành phân lập, tuyển chọn các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn. Từ 22 mẫu đƣợc thu thập trên địa bàn thành phố Hà Nội gồm: 10 mẫu sản phẩm lên men truyền thống (nƣớc hoa quả lên men, dƣa, cà muối, thịt muối, nem chua); 4 mẫu chất thải chăn nuôi; 8 mẫu phụ phẩm chế biến thực phẩm (rỉ đƣờng, bã ép hoa quả, thức ăn chăn nuôi ủ chua...), đã phân lập đƣợc 7 chủng vi khuẩnlactic. Sau khi tách và làm thuần trên môi trƣờng thạch đĩa MRS có bổ sung 0,5% CaCO3, vi khuẩnlactic đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể để xác định
82
khả năng sinh trƣởng và hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn gây thối Erwinia carotovora KT03. Kết quả trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả phân lập vi khuẩn lactic
Ký hiệu
chủng Khả năng tạo vòng phân giải CaCO3 Mật độ tế bào sau 48 giờ (x 108 CFU/ml) pH sau 48 giờ nuôi cấy
La 02 ++ 5,4 4,2- 4,5 La 05 ++ 20,0 4,3- 4,5 La 07 + 10,4 4,3- 4,5 LH19 +++ 26,2 4,0- 4,2 LH17 +++ 62,0 3,8- 4,0 LH15 +++ 16,0 4,2- 4,3 LH11 +++ 11,6 4,0- 4,2
Để xác định yếu tố kháng khuẩn của vi khuẩn lactic là do axit lactic hay do peptid kháng khuẩn, tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy trƣớc và sau trung hoà pH và xử lý bằng enzym proteaza. Sau khi trung hoà pH, dịch nuôi cấy của một số chủng vẫn có hoạt tính kháng khuẩn nhƣng khi ly tâm và xử lý bằng enzym proteaza thì lại không xuất hiện vòng vô khuẩn hoặc kích thƣớc vòng vô khuẩn giảm. Có thể vòng vô khuẩn trƣớc khi trung hoà dịch nuôi cấy là do peptid kháng khuẩn nhƣng sau khi sử lý enzym thì protein đã bị phân huỷ. Thực tế cho thấy ở trong môi trƣờng axit nhẹ, hoạt tính bacterioxin thể hiện mạnh hơn trong môi trƣờng kiềm nhẹ. Cho đến nay các chất kháng khuẩn nguồn gốc từ vi khuẩn lactic đều thuộc nhóm bacterioxin, do vậy dịch nuôi cấy thô đƣợc dùng để xác định nhanh khả năng kháng khuẩn và sàng lọc nhanh chủng có hoạt tính sinh học cao. Sau khi phân lập, các chủng đƣợc nuôi cấy 48 giờ trên môi trƣờng dịch thể MRS, xác định khả năng sinh axit lactic và hoạt tính đối kháng E. carotovora KT03 của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc.
Tất cả 7 chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm đều có khả năng sinh axit lactic (chủng thấp nhất đạt 12,14 mg/ml đƣợc phân lập từ nem chua, chủng phân lập từ rỉ đƣờng lên men có hàm lƣợng axit lactic cao nhất, đạt 31,06 mg/ml). Mặc dù ở mức
83
độ khác nhau nhƣng dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic đều có vòng ức chế đối với E. carotovora KT03, kích thƣớc vòng ức chế cao nhất đạt 22 mm; thấp nhất là 12 mm. Tuy nhiên, không có mối quan hệ tỉ lệ thuận tuyệt đối giữa hàm lƣợng axit lactic với kích thƣớc vòng vô khuẩn. Chủng vi khuẩn có hàm lƣợng axit lactic cao nhất (31,06 mg/ml) lại có vòng vô khuẩn là 16 mm, thấp hơn so với chủng có hàm lƣợng axit lactic thấp nhất (12,14 mg/ml) với kích thƣớc vòng vô khuẩn 17 mm. Điều đó chứng tỏ hầu hết các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp axit lactic đều có khả năng ức chế E. carotovora KT03, nhƣng khả năng đối kháng là do tác động tổng hợp, vừa của axit lactic vừa của peptit kháng khuẩn. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
Ký hiệu chủng Hàm lƣợng axit lactic (mg/ml) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (D-d, mm) La 02 15,05 21 La 05 13,82 16 La 07 12,14 17 LH19 27,90 22 LH17 31,06 16 LH15 22,32 17 LH11 16,10 12
Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng phân lập từ sản phẩm muối chua truyền thống (dƣa chua) ký hiệu LH19 không những có khả năng sinh trƣởng tốt mà còn có kích thƣớc vòng ức chế cao nhất. Vì vậy, chủng LH19 đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Với mục tiêu bổ sung một tổ hợp các chủng vi sinh vật có chức năng khác nhau trong vai trò vi sinh vật khởi động cho quá trình xử lý chất thải chăn nuôi nên cần thiết phải đánh giá khả năng ức chế chéo giữa các chủng. Kết quả thử nghiệm cấy vạch trên môi trƣờng thạch đĩa cho thấy 4 chủng LH19, XK112, B20 và B15 không ức chế lẫn nhau.
84
Căn cứ vào kết quả đánh giá ban đầu đã tuyển chọn đƣợc bộ chủng giống vi sinh vật cho nghiên cứu, gồm 4 chủng đƣợc trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
Kí hiệu
chủng Đƣờng kính vòng phân giải (D-d, mm) Hàm lƣợng axit lactic (mg/ml)
Đƣờng kính vòng vô khuẩn đối với E. carotovora KT03
(D-d, mm) Xenluloza Tinh bột Protein
XK112 34 20 - - -
B20 26 38 - - -
B15 - 21 30 - -
LH19 27,9 22
Hình 3.2. Hoạt tính phân giải xenluloza của chủng xạ khuẩn XK112
Hình 3.3. Hoạt tính phân giải tinh bột của chủng vi khuẩn B20
Hình 3.4. Hoạt tính phân giải protein
của chủng vi khuẩn B15 Hình 3.5. Hoạt tính kháng KT03 của chủng vi khuẩn LH19 E. carotovora