3.3.1.1. Thời gian nuôi cấy
Mục đích của nghiên cứu động thái sinh trƣởng của 4 chủng vi sinh vật là để xác định thời điểm thu sinh khối thích hợp trong quá trình lên men- một khâu quan trọng trong qui trình sản xuất chế phẩm. Từng chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy
120
riêng rẽ trong môi trƣờng và điều kiện thích hợp, xác định mật độ tế bào theo thời gian nuôi cấy. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.24.
Bảng 3.24. Động thái sinh trƣởng của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
Thời gian nuôi (giờ) Mật độ tế bào (x 108 CFU/ ml) XK112 B20 B15 LH19 24 0,48 1,6 1,6 6,2 48 18 46 46 36 72 54 45 45 32 96 50 43 43 30
Sau 24 giờ nuôi, mật độ tế bào của 4 chủng đều bắt đầu tăng, (chủng XK112 đạt 107 CFU/ ml, ba chủng B20, B15, LH19 đạt 108 CFU/ ml). Chủng XK112 đạt mật độ tế bào cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy, trong khi 3 chủng B20, B15, LH19 đạt mật độ tế bào cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy và đều đạt trên 109 CFU/ ml. Nhƣ vậy, thời điểm thu sinh khối thích hợp nhất cho chủng XK112 là 72 giờ, cho B20, B15 và LH19 là 48 giờ.
3.3.1.2.Tỷ lệ giống cấy
Lƣợng giống cấy thích hợp rất quan trọng, quyết định chất lƣợng và giá thành của sản phẩm. Trong nghiên cứu, giống đƣợc nuôi cấy trong thời gian phù hợp cho từng loại VSV. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến sinh khối bình lên men đƣợc trình bày trong bảng 3.25.
Bảng 3.25. Ảnh hƣởng tỷ lệ giống cấy đến sinh khối của 4 chủng vi sinh vật nghiên cứu
Tỷ lệ giống (%) Mật độ tế bào (x 108 CFU/ml) XK112 B20 B15 LH19 1 2,4 1,2 6,2 4,4 2 32,0 7,2 22,0 28,0 3 56,0 44,0 54,0 34,0 4 58,0 44,0 56,0 36,0 5 54,0 46,0 52,0 28,0
121
Mật độ tế bào của 4 chủng vi sinh vật đạt thấp nhất khi lƣợng giống cung cấp vào quá trình lên men là 1% và tăng dần khi tăng lƣợng giống cấp. Khi bổ sung 2% giống gốc thì 3 chủng XK112, B15 và LH19 đều đạt mật độ tế bào trên 109 CFU/ml, riêng chủng B20 có mật độ tế bào thấp hơn (chỉ đạt 7,2 x 108 CFU/ml). Khi tỷ lệ giống là 3% thì cả 4 chủng nghiên cứu đều sinh trƣởng tốt, sinh khối đạt mức ổn định > 109 CFU/ml. Không có sự chênh lệch sinh khối tế bào đáng kể giữa các tỷ lệ cấp giống 3, 4 và 5%.
Do vậy, có thể bổ sung 3% giống vào bình lên men, vừa thích hợp cho thu sinh khối vừa phù hợp với chi phí sản xuất.
3.3.1.3.Điều kiệncấp khí
Trong quá trình sinh trƣởng, 4 chủng VSV nghiên cứu có nhu cầu sử dụng ôxy khác nhau, từ kỵ khí đến hiếu khí bắt buộc. Xạ khuẩn S. griseosporeus là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên rất cần cung cấp ôxy cho quá trình phát triển; B. subtilis không sinh trƣởng trong môi trƣờng chứa glucoza ở điều kiện hiếu khí, nhƣng có thể chuyển hoá glucoza và nhiều loại đƣờng, tinh bột trong điều kiện kỵ khí; B. licheniformis sinh trƣởng dễ trong điều kiện kỵ khí và L. plantarum là vi khuẩnkỵ khí hoặc hiếu khí tuỳ tiện (không bắt buộc), không cần nhiều ôxy cho sinh trƣởng. Nuôi cấy các chủng trong điều kiện phù hợp, đánh giá nhu cầu ôxy trong quá trình lên men thông qua mối quan hệ giữa khả năng sinh trƣởng của các chủng và lƣợng không khí cấp vào.
Bảng 3.26. Ảnh hƣởng của lƣợng cấp khí đến sinh khối của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
Chủng VSV Mật độ tế bào (x 10
7 CFU/ml) tại các độ cấp khí khác nhau
0,3* 0,4* 0,5* 0,6* 0,7*
XK112 2,34 480 580 610 560
B20 360 420 340 120 66
B15 4,2 380 460 420 340
LH19 480 360 100 54 22
122
Bảng 3.26 cho thấy: khi lƣợng khí cung cấp trong quá trình lên men là 0,3 dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút, thì khả năng phát triển của 2 chủng XK112, B15 đều ở mức thấp nhất (đạt 107 CFU/ml). Khi tăng lƣợng khí cấp vào thì khả năng sinh trƣởng của 2 chủng này đều tăng nhanh chóng (đạt mức >109 CFU/ml).
Chủng xạ khuẩn XK112 sinh trƣởng tốt nhất ở mức cấp khí 0,6 dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút (đạt 6,1 x 109 CFU/ml); chủng vi khuẩn B15 sinh trƣởng tốt nhất (đạt 4,6 x 109 CFU/ml) ở mức cấp khí 0,5 dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút. Chủng B20 đạt mật độ tế bào >109 CFU/ml và tƣơng đƣơng nhau ở cả 3 mức cấp khí từ 0,3 đến 0,5 và giảm dần ở mức ≥ 0,6 dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút. Sinh trƣởng tốt nhất (4,2 x 109 CFU/ml) ở nồng độ cấp khí 0,4 dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút. Khả năng sinh trƣởng của chủng LH19 đạt mức tốt nhất (4,8 x 109CFU/ml) ở nồng độ cấp khí 0,3 dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút và có xu hƣớng giảm liên tục khi lƣợng không khí đƣa vào ≥ 0,4 dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút. Nhu cầu cung cấp oxy của XK112 và B15 là 0,5-0,6 dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút, cao hơn so với nhu cầu của chủng B20 (0,3-0,4 dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút). Riêng chủng LH19 có nhu cầu ôxy thấp nhất, có thể lên men tĩnh hoặc khuấy nhẹ (≤0,3dm3 không khí/lít môi trƣờng/phút).
3.3.1.4. Môi trƣờng nhân sinh khối
Với mục tiêu chuyển giao công nghệ sản xuất chế phẩm cho các địa phƣơng và hạ giá thành sản phẩm, đề tài tiến hành lựa chọn môi trƣờng lên men nhân sinh khối theo tiêu chí thay thế các hoá chất đắt tiền bằng nguyên liệu tự nhiên hoặc có nguồn cung cấp thuận lợi, dễ tìm, thành phần môi trƣờng đơn giản, dễ thao tác.
Căn cứ vào kết quả thử nghiệm đã lựa chọn đƣợc 3 môi trƣờng sản xuất (SX1, SX2, SX3) thay thế cho môi trƣờng đặc hiệu của 4 chủng nghiên cứu (môi trƣờng Gauze cho XK112; môi trƣờng King B cho B20, B15 và môi trƣờng MRS cho LH19). Các chủng đƣợc nuôi cấy riêng lẻ trong môi trƣờng, điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian thích hợp, xác định khả năng sinh trƣởng của các chủng.
Kết quả nghiên cứu (Bảng 3.27)cho thấy, môi trƣờng SX1 phù hợp cho sinh trƣởng và phát triển của chủng XK112; chủng LH19 cho sinh khối cao nhất trên
123
môi trƣờng SX2; còn chủng B20 và B15 sinh trƣởng tốt hơn trên môi trƣờng SX3. Trong các môi trƣờng sản xuất thích hợp, các chủng đều đạt mật độ tế bào ≥109 CFU/ml.
Bảng 3.27. Khả năng sinh trƣởng của các chủng VSV nghiên cứu trên các môi trƣờng sản xuất
Chủng VSV
Mật độ tế bào (x 108 CFU/ml) trên các môi trƣờng
SX1 SX2 SX3
XK112 53,6 3,42 6,8
B20 6,4 7,0 48
B15 4,08 5,34 56
LH19 10,2 44 26
Từ các kết quả nghiên cứu trên, các yếu tố kỹ thuật thích hợp cho quá trình lên men của 4 chủng vi khuẩnnghiên cứu đã đƣợc tổng hợp trong bảng 3.28.
Bảng 3.28. Điều kiện thích hợp nhân sinh khối của các chủng VSV nghiên cứu
Thông số kỹ thuật Chủng VSV
XK112 B20 B15 LH19
pH 7,3± 0,2 7,0± 0,2 7,0± 0,2 6,5± 0,2
Nhiệt độ nhân sinh khối (oC) 37± 2 30± 2 30± 2 35± 2
Thời gian nhân sinh khối (giờ) 72 48 48 48
Tỷ lệ giống gốc (%) 3 3 3 3
Môi trƣờng nhân sinh khối SX1 SX3 SX3 SX2
Lƣu lƣợng cấp khí (dm3
KK/dm3 môi trƣờng/phút) 0,5- 0,6 0,3- 0,4 0,5- 0,6 ≤ 0,3
3.3.2. Quy trình sản xuất chế phẩm
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các yếu tố thích hợp cho quá trình nhân sinh khối của các chủng vi sinh vật (nhƣ pH, nhiệt độ, thời gian, môi trƣờng, lƣợng khí cấp...) và tham khảo những công trình nghiên cứu trƣớc đây, quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật để xử lý nhanh chất thải chăn nuôi đƣợc xây dựng
124 theo sơ đồ tóm tắt sau (Hình 3.26):
Hình 3.26. Sơ đồ Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi
Qui trình gồm các khâu chính như sau:
(1) Chuẩn bị sinh khối vi sinh vật: Bốn chủng đƣợc nuôi cấy riêng rẽ trong môi trƣờng và điều kiện thích hợp, sau khi nhân giống cấp 1 đƣợc chuyển sang bình lên men nhân sinh khối cấp II với tỷ lệ 3%. Giống và sinh khối đều đƣợc kiểm tra độ thuần khiết và hoạt tính sinh học. Cần chú ý là giống cấy phải gồm các tế bào trẻ và có sức sống cao, nên phải chọn ở pha logarit.
Chất mang (than bùn)
Kiểm tra hoạt tính
Kiểm tra hoạt
tính Kiểm tra hoạt tính
Nhân giống cấp I Nhân giống cấp I Nhân giống cấp I
Nhân giống cấp II Nhân giống cấp II Nhân giống cấp II
Phối trộn
Kiểm tra chất lƣợng
Bao gói
Bảo quản sử dụng
Xạ khuẩn phân giải xenluloza (Streptomyces griseosporeus)
Vi khuẩn phân giải tinh bột
(Bacillus licheniformis)
Vi khuẩn lactic kháng khuẩn, khƣ̉ mùi hôi
(Lactobacillus plantarum)
Lên men xốp Lên men xốp Lên men xốp
Môi trƣờng lên men cấp II Môi trƣờng lên
men cấp I
Vi khuẩn phân giải protein
(Bacillus subtilis)
Kiểm tra hoạt tính Nhân giống cấp I Nhân giống cấp II Lên men xốp Bổ sung dinh dƣỡng Sấy khô
125
(2) Chuẩn bị chất mang: Than bùn đƣợc phơi khô tự nhiên, nghiền mịn bằng máy, rây qua sàng 0,1 mm sau đó sử dụng vôi bột điều chỉnh pH về 6,5.
(3) Phối trộn, kiểm tra chất lƣợng: Dịch vi sinh vật đƣợc phối trộn đều với chất mang theo tỷ lệ 5/100. Nguồn dinh dƣỡng đƣợc bổ sung thêm là cám gạo (0,5%), rỉ đƣờng (1%), urê (0,2%), kali sunphát (0,2%), sau đó ủ 3 ngày rồi hong khô hoặc sấy nhẹ (ở 500C để đạt độ ẩm khoảng 20%). Kiểm tra chất lƣợng, đóng gói.
(4) Bảo quản, sử dụng: Chế phẩm đƣợc đóng gói trong túi ni lông tráng thiếc hoặc tối màu, khối lƣợng 1 kg/túi, trên bao bì ghi đầy đủ thông tin liên quan của sản phẩm và hƣớng dẫn sử dụng. Bảo quản chế phẩm trong phòng thoáng khí, điều kiện thƣờng, kiểm tra mật độ, hoạt tính của vi sinh vật theo thời gian định kỳ.
3.3.3. Chất lƣợng chế phẩm
Trên cơ sở đánh giá hoạt tính sinh học, khả năng ức chế chéo trên môi trƣờng thạch đĩa và trong dịch thể chọn đƣợc tổ hợp 4 chủng VSV và đã nghiên cứu các yếu tố thích hợp cho nhân sinh khối và sản xuất chế phẩm. Tuy nhiên trong quá trình sản xuất và bảo quản chế phẩm cần tiếp tục kiểm tra khả năng tồn tại, hoạt tính sinh học của các chủng trong điều kiện phối trộn hỗn hợp trên nền chất mang.
Bảng 3.29. Khả năng tồn tại của 4 chủng vi sinh vật trong chế phẩm
Chủng VSV Mật độ tế bào (x 108CFU/ml) 0 giờ 7 ngày 1 tháng 2 tháng 3 tháng 6 tháng XK112 5,6 40 56 52 42 4,6 B20 4,4 32 45 36 64 2,4 B15 5,2 46 55 40 18 3,8 LH19 3,6 32 12 62 1,4 0,42
Đặc điểm của chế phẩm là sử dụng ba chủng vi khuẩn có bào tử (gồm S. griseosporeus, B. subtilis, B. licheniformis)nên có thể bảo quản trong thời gian lâu dài. Mật độ tế bào của 3 chủng XK112, B20, B15 đạt 109 CFU/g sau 3 tháng và 108 CFU/g sau 6 tháng bảo quản. Riêng chủng LH19 có mật độ tế bào thấp hơn (đạt 108 CFU/g sau 3 tháng và 107 CFU/g sau 6 tháng bảo quản).
126
Bảng 3.30. Hoạt tính của 4 chủng vi sinh vật trong chế phẩm
Chủng VSV
Đƣờng kính vòng phân giải (D-d, mm) sau thời gian bảo
quản chế phẩm kháng Đƣờng kính vòng E. carotovora KT03 (D-d, mm)
Xenluloza Tinh bột Protein
3 tháng 6 tháng 3 tháng 6 tháng 3 tháng 6 tháng 3 tháng 6 tháng
XK112 34 33 19 18 - - - -
B20 27 25 38 36 - - - -
B15 - 22 20 28 27 - -
LH19 - - - - - - 22 20
Hoạt tính sinh học của các chủng sau 3 tháng bảo quản đều tƣơng đƣơng so với hoạt tính ban đầu (bảng 3.7 và hình 3.27), sau 6 tháng hoạt tính vẫn tƣơng đối ổn định. Chế phẩm bảo quản 3- 6 tháng trong điều kiện thƣờng đảm bảo chất lƣợng theo qui định. Nhƣ vậy, các yếu tố kỹ thuật lựa chọn trong qui trình sản xuất thử nghiệm là phù hợp cho sản xuất chế phẩm vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi.
A: Xenlulaza của chủng XK112 B: Amylaza của chủng B20 C: Proteaza của chủng B15 D: Kháng E. coli của chủng LH19
A1: Amylaza của chủng XK112 B1: Xenlulaza của chủng B20 C1: Amylaza của chủng B15 D1: Kháng Erwinia của chủng LH19 Hình 3.27. Hoạt tính của 4 chủng XK112, B20, B15 và LH19 trong chế phẩm
127
3.4. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI NUÔI
3.4.1. Hiệu quả xử lý chất thải chăn nuôi
Qui trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn đƣợc xây dựng căn cứ vào kết quả nghiên cứu của tác giả và kế thừa kết quả nghiên cứu đã đƣợc công bố trong nƣớc và trên thế giới [10, 17, 34, 47, 57, 61, 77, 109, 116]. Quy trình này áp dụng cho các trang trại chăn nuôi qui mô tập trung.
Qui trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi thành phân hữu cơ đƣợc tóm tắt theo sơ đồ sau (Hình 3.28):
(Chất thải chăn nuôi + than bùn, trấu, rơm rạ khô theo tỷ lệ 1:1đến 2:1)
Hình 3.28. Sơ đồ Quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn thành phân hữu cơ
- Cơ chất đƣợc điều chỉnh pH đạt 6- 7, là pH thích hợp cho các chủng vi sinh vật hoạt động và giảm thất thoát nitơ do bay hơi NH3. Dùng vôi bột để trung hoà pH và hạn chế sự phát triển của quần thể vi sinh vật có sẵn trong chất thải chăn nuôi.
Chất thải chăn nuôi dạng rắn Chế phẩm VSV Phối trộn Điều chỉnh pH, độ ẩm, tỷ lệ C/N Ủ nóng Đảo trộn, ủ chín, để hoai đến nhiệt độ không đổi
Làm khô, đóng bao, Kiểm tra, Sử dụng
128
- Điều chỉnh độ ẩm ban đầu của khối ủ trong khoảng 55-65% để sản phẩm sau quá trình ủ đạt khoảng 20-25%.
- Điều chỉnh tỷ lệ C/N, bổ sung N, P, rỉ đƣờng vào đống ủ với mục đích cung cấp nguồn dinh dƣỡng, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật trong chế phẩm phát triển ở giai đoạn đầu của quá trình ủ.
- Nhiệt độ đống ủ đƣợc điều chỉnh bằng biện pháp đảo trộn, thông khí, nhiệt độ phù hợp cho quá trình ủ là khoảng 45- 600C.
- Kích cỡ nguyên liệu nhỏ làm tăng khả năng phân giải của vi sinh vật nhƣng lại hạn chế lƣu lƣợng khí trao đổi, vì vậy phải cân đối giữa hai yếu tố này.
Cung cấp khí trong quá trình ủ có tác dụng ổn định nhiệt độ khối ủ, làm khô nguyên liệu, đồng thời tăng cƣờng oxy cho VSV hoạt động. Thể tích khí trong đống ủ phải đạt khoảng 20-30%, lƣợng khí cần thiết khoảng 2,5 lit/g nguyên liệu khô.
3.4.1.1. Động thái nhiệt độ đống ủ
Nhiệt độ là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá diễn biến và hiệu quả quá trình ủ. Giai đoạn đầu của quá trình ủ, quá trình chuyển hoá các hợp chất hữu cơ giải phóng ra năng lƣợng, nhiệt độ tăng lại góp phần thúc đẩy quá trình chuyển hoá.
Khi nhiệt độ tăng cao trên 600C, quần thể vi sinh vật trong đống ủ sẽ giảm mạnh làm gián đoạn quá trình chuyển hóa cơ chất, vì vậy cần kiểm soát để điều chỉnh nhiệt độ đống ủ cho phù hợp. Khảo sát biến động nhiệt độ đống ủ tại các điểm thử nghiệm trên 2 loại chất thải chăn nuôi gà và lợn dạng rắn đã đƣợc tiến hành với 2 công thức: Đối chứng không xử lý bằng vi sinh vật và thí nghiệm xử lý bằng vi sinh vật. Đo nhiệt độ khối ủ ở thời điểm 9 giờ các ngày. Thực hiện đảo trộn vào ngày thứ 7, thứ 15 và lấy mẫu vào ngày thứ 21.
Kết quả trong bảng 3.31 cho thấy nhiệt độ đống ủ thay đổi rất lớn theo các giai đoạn của quá trình phân giải chất hữu cơ và chu kỳ đảo trộn khối ủ.
Sau thời gian ủ 1-2 ngày, nhiệt độ khối ủ bắt đầu tăng khoảng 100C ở công thức thí nghiệm và khoảng 50C ở công thức đối chứng. Khi bổ sung vi sinh vật, nhiệt độ khối ủ tăng nhanh trong vòng 4-7 ngày, đạt cực đại (60,50C ở đống ủ phân lợn và 610C ở đống ủ phân gà) ở ngày thứ 7. Sau khi đảo trộn ở ngày thứ 7, nhiệt độ