Amylaza rất phổ biến ở vi sinh vật, thuộc nhóm enzym xúc tác cho sự phân giải liên kết nội phân tử trong polysacarit với sự tham gia của nƣớc. Cơ chất của amylaza là tinh bột và glycogen, theo tính chất và cách tác dụng lên tinh bột, phân biệt amylaza thành các loại: -amylaza, -amylaza, glucoamylaza và oligo 1-6 glucozidaza [37, 89, 114].
* -Amylaza (-1,4 glucan-glucanhydrolaza )
-amylaza từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm giống nhau. Phân tử lƣợng của các -amylaza từ các nguồn khác nhau xấp xỉ 40.000 kDa. -amylaza có khả năng phân cắt các liên kết -1,4 glycozit nằm phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên không tuân theo trình tự nào. Liên kết -1,6 glycozit không bị thuỷ phân sẽ phong toả các liên kết -1,4 gần nó, làm cho -amylaza không đƣợc tác dụng, vì thế với amylopectin thì sản phẩm tạo ra là các dextrin chứa cả liên kết - 1,4 và -1,6 glycozit.
Khi tác dụng lên tinh bột, enzym này giải phóng glucoza ở dạng - amutanmer nên đƣợc gọi là -amylaza. -amylaza có khả năng thuỷ phân tinh bột và thuỷ phân bột thô. Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm nhiều giai đoạn khác nhau. Thông thƣờng thì -amylaza chỉ thuỷ phân tinh bột thành các phân tử dextrin có khối lƣợng phân tử thấp (không cho màu xanh với iot) và một ít maltoza. -amylaza dễ tan trong nƣớc, trong các dung dịch muối và rƣợu loãng. Các protein -amylaza có tính chất axit béo và tính chất của globulin, điểm đẳng điện nằm trong phạm vi vùng 4,2- 5,7 [theo 7, 16, 96].
-amylaza là một metalo enzym trong phân tử có chứa ion canxi, khi tách hoàn toàn Ca2+ ra khỏi phân tử thì enzym bị mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất vì Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc III và duy trì cấu hình của enzym. -amylaza bền nhiệt hơn so với các amylaza khác, tất cả các - amylaza đều bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng nhƣ Cu2+, Hg2+, Ag2+... Một loạt các ion kim loại nhƣ Li+, Na+, Mg2+, Cr3+, Mn2+, Co2+, Sn2+, Cd2+ không có ảnh hƣởng đến -
42
amylaza, điều kiện hoạt động của -amylaza từ các nguồn khác nhau thƣờng không giống nhau [Theo 7, 51, 59, 60, 73, 82].
Những khác biệt về tính chất (nhiệt độ, pH tối thích, mức độ thuỷ phân và đặc tính thuỷ phân) của -amylaza từ các nguồn khác nhau đã mở ra triển vọng to lớn cho việc ứng dụng chúng một cách thích hợp và hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất [15, 21, 37, 41].
* -Amylaza (-1,4 Glucan maltohydrolaza)
-Amylaza xúc tác thuỷ phân liên kết 1-4 glycozit trong tinh bột, glycogen và polysacarit đồng loại, phân cắt tuần tự gốc glucoza từ đầu không khử của mạch.
-amylaza hầu nhƣ không thuỷ phân hạt tinh bột nguyên vẹn mà thuỷ phân mạnh mẽ hồ tinh bột. -amylaza phân giải 100% amyloza thành matoza và phân giải 54- 55% amylopectin thành matoza. Matoza tạo thành có cấu hình , vì thế enzym tƣơng ứng đƣợc gọi là -amylaza. -Amylaza có trung tâm xúc tác chứa các nhóm - SH và COOH cùng với đƣờng imidazol của gốc histidin [Theo 7, 16, 55].
-Amylaza hoạt động tối thích ở pH 4,6 và nhiệt độ 10-50oC, bị bất hoạt ở 70oC. Khác với -amylaza, nó liên kết rất bền khi không có mặt Ca2+. -amylaza bị kìm hãm hoàn toàn bởi Cu2+, Hg+, iot, ozon… [Theo 7, 82, 91].
Hình 1.8. Mô hình cấu trúc phân tử bậc II của -amylaza
Hình 1.9. Mô hình cấu trúc phân tử bậc IIcủa -amylaza
* Glucoamylaza (-1,4 D-glucan-glucanohydrolaza)
Glucoamylaza là một exoenzym, thuỷ phân liên kết 1-4 glycozit trong phân tử polysacarit, tách tuần tự từng gốc glucoza khởi đầu không khử của mạch. Nó cũng thuỷ phân liên kết -1,6 glucozit và -1,3, chịu ảnh hƣởng của kích cỡ cấu
43
trúc phân tử và các liên kết kế bên. Tại các điểm phân nhánh thì tốc độ thuỷ phân chậm hơn glucoamylaza có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, amylopectin, dextrin, izomanoza và mantoza tới glucoza. Đa số glucoamylaza thuộc loại enzym "axit" thể hiện hoạt độ tối đa ở pH 3,5-5,5. So với -amylaza thì glucoamylaza bền với axit hơn nhƣng kém bền với tác dụng của rƣợu etylic, axit axetic và không đƣợc bảo vệ bằng Ca2+ [55, 82, 91, 109].
* Oligo-1,6 glucozidaza (dextrinaza tới hạn)
Enzym này thuỷ phân các liên kết -1-6 glycozit trong izomantoza, các dextrin tới hạn và có khả năng chuyển hoá chất này tới đƣờng lên men đƣợc. Nó thuỷ phân dextrin mạnh hơn so với và -amylaza [Theo 7, 16, 55].
1.2.2.3. Vi sinh vật tổng hợp enzym thuỷ phân tinh bột
Vi sinh vật là nguồn sinh amylaza rất lớn. -amylaza đƣợc thấy ở hầu hết các loại VSV nhƣ nấm sợi, nấm men giả, vi khuẩn có bào tử và xạ khuẩn. Ở vi khuẩn, amylaza chủ yếu đƣợc sinh ra từ các loài thuộc chi Clostridium, Bacillus nhƣ B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. caldovelox [59, 60, 73, 91, 96], B. licheniformis
[51, 53, 82, 114], Bifidobacterium [75]…
Amylaza của vi khuẩn khác với nấm sợi ở chỗ ít có khả năng đƣờng hoá nhƣng lại dịch hoá hồ tinh bột rất mạnh, tạo thành những -dextrin phân tử lƣợng cao bắt màu với iot. -amylaza của vi khuẩn giống với của nấm men ở chỗ là chúng đƣợc ổn định bằng ion canxi. Do có khả năng chịu nhiệt cao và có phổ pH rộng (từ chịu axit đến chịu kiềm) nên -amylaza của vi khuẩn đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây. Số lƣợng gien mã hoá -amylaza của vi khuẩn đã đƣợc tách dòng cũng chiếm tỷ lệ cao trong ngân hàng dữ liệu gien [55].
Hiện nay, có nhiều công trình nghiên cứu về tính chịu nhiệt của -amylaza từ vi khuẩn [12, 21, 37, 41, 53, 73, 114], các tác giả này đã phân lập đƣợc các chủng vi khuẩn sinh -amylaza chịu nhiệt cao, xác định đƣợc ảnh hƣởng của tỉ lệ C: N lên hoạt tính của enzym và ion Ca2+, Mg2+ làm ổn định -amylaza ở nhiệt độ cao. Hoạt tính amylaza có nhiệt độ tối ƣu ở 75- 85oC, pH tối ƣu là 6,5- 7,5.
44
Các muối amoni của axit vô cơ (NH4H2PO4, (NH4)2SO4, NH4Cl) cho hiệu quả sinh tổng hợp -amylaza thấp. Ngƣợc lại, các axit amin thƣờng cho hiệu quả tổng hợp -amylaza cao, vì vậy ngƣời ta hay bổ sung các dịch thuỷ phân protein vào môi trƣờng nuôi vi sinh vật.
Chế phẩm -amylaza từ vi sinh vật đã đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp và đƣợc sản xuất với lƣợng lớn. Chế phẩm glucoamylaza tách từ VSV có nhiều triển vọng ứng dụng trong sản xuất bia, rƣợu, maltoza và glucoza. Vi sinh vật sinh tổng hợp amylaza đƣợc ứng dụng nhiều trong xử lý rác thải, chất thải nông nghiệp, nƣớc thải giàu tinh bột từ các làng nghề chế biến [Theo 7, 12, 16].
1.2.3. Vi sinh vật phân giải protein
Protein là các polyme phân tử lớn, chủ yếu bao gồm các L. axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit, khối lƣợng phân tử của protein từ hàng trăm đến hàng triệu dalton [Theo 2, 119].
1.2.3.1. Enzym proteaza (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Giới thiệu chung
Proteaza đƣợc phân bố rất rộng rãi ở nhiều đối tƣợng. So với proteaza động vật và thực vật, proteaza vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trƣớc hết, hệ proteaza vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp, bao gồm nhiều enzym rất giống nhau về cấu trúc, khối lƣợng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dƣới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzym khác nhau nên proteaza vi sinh vật thƣờng có tính đặc hiệu rộng rãi, cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Một loại vi sinh vật có thể tạo ra nhiều loại proteaza khác nhau. Ngƣời ta đã tách chiết nhiều loại proteaza khác nhau từ vi sinh vật mà chủ yếu là từ vi khuẩn và nấm mốc [2, 19, 20, 29, 120, 122].
Nhóm enzym proteaza (peptit- hydrolaza 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein hoặc polypeptit, tao các sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều proteaza cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin [120, 122].
45
* Phân loại proteaza
- Dựa vào tính tác động đặc hiệu, ngƣời ta chia proteaza thành 2 loại [2, 16]:
+ Proteaza (hay enđopeptidaza): Thuỷ phân protein thành các đoạn peptit (pepton, oligopeptit). Chúng có tính đặc hiệu tƣơng đối rộng.
+ Peptidaza (hay exopeptidaza): Chủ yếu phân cắt các liên kết peptit ở đầu, cuối mạch, giải phóng các axit amin tự do. Có tính đặc hiệu hẹp, chỉ tác dụng lên liên kết peptit tại những vị trí nhất định.
- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidazae đƣợc chia thành hai loại [120, 122]:
+ Aminopeptidaza: Xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của chuỗi polypeptit để giải phóng ra amino axit, một dipeptit hoặc một tripeptit. + Carboxypeptidaza: Xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu C của chuỗi polypeptit và giải phóng ra một amino axit hoặc một dipeptit.
- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidaza đƣợc chia thành bốn nhóm [120,122]:
+ Serin proteinaza: Là những proteinaza chứa nhóm –OH của gốc serin trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzym. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzym, động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, elastaza.
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzym vi khuẩn nhƣ subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serin proteinaza thƣờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng.
+ Cystein proteinaza: Là các proteinaza chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinaza bao gồm các proteinaza thực vật nhƣ papain, bromelin, một vài protein động vật và proteinaza ký sinh trùng. Các cystein proteinaza thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinaza: Hầu hết các aspartic proteinaza thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepxin bao gồm các enzym tiêu hóa nhƣ: pepxin, chymosin, cathepsin, renin.
46
Các aspartic proteinaza có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinaza (Proteinaza kim loại): Là nhóm proteinaza gặp ở VK, nấm mốc cũng nhƣ các VSV bậc cao hơn. Các metallo proteinaza thƣờng hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA.
- Ngoài ra, proteaza đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: proteaza axit; proteaza trung tính; proteaza kiềm có pH hoạt động lần lƣợt là: pH 2- 4, pH 7-8, pH 9-11 [120, 122].
1.2.3.2. Vi sinh vật tổng hợp enzym phân giải protein
* Vi khuẩn
Lƣợng proteaza sản xuất từ vi khuẩn ƣớc tính vào khoảng 500 tấn/năm, chiếm 59% lƣợng enzym đƣợc sử dụng. Proteaza của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidaza hoặc exopeptidaza, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên. Do đó proteaza của vi khuẩn, có tính đặc hiệu cao với cơ chất. Có khả năng phân hủy tới 80%, các liên kết peptit trong phân tử protein một cách nhanh chóng. Ngoài ra, có thể phân huỷ một số liên kết không đặc trƣng [120, 122].
Các loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh proteaza là: Bacillus subtilis
[2, 19, 20, 29, 74], B. horikoshii [76], B. mesentericus, B. thermoproteolyticus, B. polymyxa [68], B. mojavensis [35] và một số loài thuộc chi Serratia sp [19], Vibrio fluvialis [88], Clostridium, Pseudomonas [64], Pseudomonas aeruginosa [64, 93, 97]. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp proteaza mạnh nhất [2, 19, 20, 74].
Các vi khuẩn thƣờng tổng hợp các proteaza hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
+ Các proteaza trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các proteaza trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với proteaza động vật đồng thời làm tăng giá trị dinh dƣỡng. Các proteaza trung tính có ái lực cao đối với các amino axit ƣa béo và thơm.
47
+ Proteaza của Bacillus ƣa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lƣợng phân tử từ 20.000 đến 30.000, ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng (7-12) [19, 20, 29, 68, 74, 76, 78].
* Nấm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhiều loài nấm mốc có khả năng tổng hợp proteaza và đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhƣ: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum…Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại proteaza: axit, kiềm và trung tính.
Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các proteaza axit có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3. Một số nấm mốc khác nhƣ: A. candidatus, P. camemberti, P. roqueforti…cũng có khả năng tổng hợp proteaza, có khả năng làm đông tụ sữa đƣợc sử dụng trong sản xuất pho mát [Theo 7, 12, 119, 120, 122].
* Xạ khuẩn
Trong các nhóm vi sinh vật tổng hợp proteaza, xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên ngƣời ta cũng đã tìm đƣợc một số loài có khả năng tổng hợp proteaza cao nhƣ: Streptomyces griseus, S. fradiae, S. trerimosus…[Theo 7, 119, 120, 122].
Chế phẩm proteaza từ xạ khuẩn đƣợc biết nhiều là Pronase (Nhật) đƣợc tách chiết từ S. grieus. Enzym này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptit của nhiều protein thành axit amin .
Ở Liên Xô (cũ), ngƣời ta cũng tách đƣợc chế phẩm tƣơng tự từ S. grieus có tên là Protelin. Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết đƣợc keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, chế phẩm đƣợc sản xuất có tên là M-Zim dùng trong công nghiệp da. Proteaza từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastaza cao, do đó chúng đƣợc dùng trong công nghiệp chế biến thịt.
Hầu hết các proteaza phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzym này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptit định trƣớc. Các yếu tố tăng cƣờng quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm
48
carboxyl hoặc nhóm amin đƣợc lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng [118, 120, 122].
1.2.4. Vi khuẩn tổng hợp axit lactic và bacterioxin
Vi khuẩn lactic thuộc nhóm Gram (+), không tạo bào tử, hầu hết không di động, có hình thái khác nhau. Vi khuẩn lactic lên men bắt buộc, có thể sinh trƣởng đƣợc khi có mặt 02 vì vậy chúng thuộc nhóm kị khí hoặc hiếu khí tùy tiện. Vi khuẩn lactic thu nhận năng lƣợng nhờ quá trình phân giải kị khí đƣờng, hyđrat các bon với sự tích luỹ axit lactic trong môi trƣờng [11, 83, 84].
Từ xa xƣa, vi khuẩn lactic đƣợc biết đến bởi khả năng sinh axit lactic góp phần làm tăng sự phân hủy các hợp chất hữu cơ nhƣ xenluloza, tinh bột, sau đó lên men chúng mà không ảnh hƣởng đến các chất hữu cơ chƣa phân hủy. Ngƣời ta đã ứng dụng rộng rãi quá trình lên men lactic với mục đích chuyển hoá thức ăn khó tiêu thành dễ tiêu, lên men thực phẩm cho ngƣời, gia súc, sản xuất axit lactic.
Ngoài ra, axit lactic là chất tiệt trùng mạnh có khả năng tiêu diệt, ngăn ngừa sự lan truyền các vi sinh vật có hại vì vậy đƣợc ứng dụng trong bảo quản, chế biến thực phẩm, trong y, dƣợc và xử lý môi trƣờng [11, 46, 83, 84].
Không chỉ sinh axit lactic, vi khuẩn lactic còn đƣợc đặc biệt quan tâm nghiên cứu về khả năng sinh bacterioxin dạng protein kháng khuẩn. Bacterioxin có mặt trong tất cả các chi vi khuẩn lactic nhƣ: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc và Pediococcus, trong đó hai nhóm chính là:
Lactobacillus, Lactococcus đóng vai trò quan trọng [5, 8, 13, 45, 50].
Bacterioxin của vi khuẩn lactic có nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ phổ kháng khuẩn đa dạng, tính đặc hiệu tế bào đích cao, an toàn với ngƣời, vật nuôi, cây trồng và môi trƣờng. Do đó bacterioxin của vi khuẩn lactic đƣợc xem là các chất diệt khuẩn thế hệ mới có thể giải quyết tình trạng nhờn kháng sinh và chất tiệt trùng hóa học, là giải pháp cho vấn đề kiểm soát các nguồn bệnh nhiễm trùng đang đặt ra nhiều thách thức hiện nay [13, 45, 46, 58, 95, 103, 104, 105, 112]. Vì vậy trong phần tổng quan tài liệu của luận án tập trung nghiên cứu bacterioxin và khả năng tổng hợp bacterioxin của vi khuẩn lactic.
49
1.2.4.1. Bacterioxin
* Khái niệm
Bacterioxin là chất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein do vi khuẩn tổng hợp nhằm ức chế các loài vi khuẩn có quan hệ gần gũi, tƣơng đồng hoặc một số vi sinh vật có cùng môi trƣờng, có sự cạnh tranh trực tiếp về nơi sống và nguồn dinh dƣỡng nhƣng không ức chế bản thân vi khuẩn sinh ra bacterioxin đó [103, 104, 105, 112]. Các bacterioxin đều là các peptit ngoại bào có hoạt tính sinh học, hầu hết