Chủng vi khuẩn B20 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể. Xác định ảnh hƣởng của yếu tố nuôi cấy (nhiệt độ, pH môi trƣờng) đến khả năng sinh trƣởng và hoạt tính phân giải tinh bột của chủng vi khuẩn B20 trong dịch nuôi cấy. Khi xác
100
định ảnh hƣởng của một yếu tố thì giữ các yếu tố khác trong điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất.
* Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng điều hoà quá trình tổng hợp amylaza của vi sinh vật. Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng và hoạt tính amylaza của chủng vi khuẩn B20 giúp cho việc lựa chọn nhiệt độ tối ƣu khi nhân sinh khối cũng nhƣ điều chỉnh nhiệt độ của đống ủ trong quá trình xử lý nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho chủng giống sinh trƣởng và thúc đẩy quá trình phân giải chất hữu cơ trong chất thải chăn nuôi.
Chủng vi khuẩn B20 đƣợc nuôi cấy lắc trên môi trƣờng dịch thể ở các nhiệt độ: 30, 37, 40, 50 và 550C, sau 48h xác định khả năng sinh trƣởng (bằng đo mật độ quang ở bƣớc sóng 620nm) và hoạt tính amylaza thông qua kích thƣớc vòng phân giải trên môi trƣờng thạch đĩa (1% tinh bột với thuốc thử Lugol).
32.5 38 37.5 33 21 1.3 2.1 2.4 2.2 1.8 0 5 10 15 20 25 30 35 40 30 37 Nhiệ40t độ (oC) 50 55 Đ ƣờ ng k ín h V PG (mm ) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 OD (6 20 n m) Đƣờng kính VPG (mm) OD (620nm)
Hình 3.18. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng và khả năng phân giải tinh bột của chủng B20
Hình 3.18 cho thấy chủng vi khuẩn B20 có khả năng phân giải tinh bột ở cả 5 mốc nhiệt độ nghiên cứu. Sinh khối tế bào và kích thƣớc vòng phân giải tinh bột đạt mức cao nhất ở 370C (mật độ quang và đƣờng kính vòng phân giải tƣơng ứng là OD 2,4 và 38 mm) và giảm dần theo chiều tăng của nhiệt độ. Khả năng sinh trƣởng đạt mức cao (OD>2,0) ở nhiệt độ 30- 400C, nhƣng hoạt tính amylaza lại đạt mức cao
101
(đƣờng kính vòng phân giải > 30mm) trong khoảng nhiệt độ 30- 500C. Ở nhiệt độ 550C, khả năng sinh trƣởng cũng nhƣ phân giải tinh bột đều giảm mạnh (OD đạt 1,3 và đƣờng kính vòng phân giải là 21mm).
Các số liệu này cũng phù hợp với kết quả đã công bố về khoảng nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Bacillus tổng hợp amylaza [7, 41, 59, 73] nhƣng nhiệt độ tối ƣu của chủng B20 thấp hơn so với nhiệt độ tối ƣu của một số chủng bacillus phân giải tinh bột khác. Ngô Xuân Mạnh và cs [14] đã lựa chọn đƣợc nhiệt độ tối ƣu nuôi cấy chủng B. licheniformis BCRP để thu nhận enzym -amylaza là 420C. Kết quả nghiên cứu của các tác giả Ashger và cs [37], Nadia riaz và cs [96] cũng cho thấy nhiệt độ tối ƣu cho khả năng tổng hợp amylaza của B. subtilis là 400C.
Kết quả nghiên cứu khẳng định chủng B20 có khả năng phân giải tinh bột trong dải nhiệt độ 30- 550C và thích hợp ở biên độ 30- 500C. Khoảng nhiệt độ này phù hợp với giai đoạn 5- 10 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi, khi đó quá trình phân giải tinh bột trong khối ủ diễn ra mạnh nhất.
* Ảnh hưởng của pH
Nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng và hoạt tính sinh họccủa vi sinh vật giúp cho việc lựa chọn pH tối ƣu khi nhân sinh khối và điều chỉnh pH của chất thải chăn nuôi trƣớc khi ủ, tạo điều kiện thuận lợi cho chủng giống sinh trƣởng và tổng hợp enzym thúc đẩy quá trình phân giải chất hữu cơ. Chủng vi khuẩn B20 đƣợc nuôi lắc (220 vòng/phút) trong môi trƣờng dịch thể bổ sung cơ chất là tinh bột tan ở các pH khác nhau (4,0 , 5,0 , 6, 6,5, 7,0, 7,5 và 9,0). Sau 48h xác định khả năng sinh trƣởng (bằng đo mật độ quang ở bƣớc sóng 620nm) và hoạt tính amylaza thông qua kích thƣớc vòng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch đĩa chứa 1% tinh bột tan, nhuộm màu với thuốc thử Lugon.
Kết quả (hình 3.19) cho thấy: Ở pH 4,0 chủng vi khuẩn B20 sinh trƣởng yêú (OD chỉ đạt 0,8), đƣờng kính vòng phân giải đạt mức thấp nhất (9,6 mm). Khả năng sinh trƣởng cũng nhƣ hoạt tính amylaza tăng nhanh và liên tục từ pH 5,0. Sinh khối đạt mức cao nhất ở pH 7,0 (OD 2,4). Ở pH 7,5 khả năng sinh trƣởng bắt đầu có xu hƣớng giảm nhƣng hoạt tính amylaza lại đạt cao nhất (đƣờng kính vòng phân giải là
102
38,2 mm). Với pH 8,0 sinh khối tế bào và kích thƣớc vòng phân giải tinh bột đều giảm nhanh (lần lƣợt là OD 1,7 và 33 mm ) nhƣng vẫn ở mức cao hơn nhiều so với ở pH 4 và 5. 20.3 29 33.3 38 38.2 33 9.6 1.2 1.7 2.1 2.4 2.2 1.7 0.8 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 4 5 6 6.5pH 7 7.5 8 Đ ƣ ờn g kí nh V P G (mm) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 O D ( 620n m) Đƣờng kính VPG (mm) OD (620nm)
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng và khả năng phân giải tinh bột của chủng B20
Kết quả nghiên cứu này khá phù hợp với kết quả của một số công trình đã đƣợc công bố [7, 41, 59, 73]. Nghiên cứu của Đỗ Bích Thuỷ và cs [21] xác định đƣợc pH thích hợp cho chủng B.subtilis tổng hợp -amylaza là 6- 7,5 với pH tối ƣu là 7,0. Ashger và cs [37] chọn đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu để chủng B. subtilis
JS2004 tổng hợp amylaza là pH7. Nadia riaz và cs [96] cũng kết luận pH thích hợp để B. subtilis tổng hợp -amylaza là 6- 8 với pH tối ƣu là 7,5. Ngô Xuân Mạnh và cs [14] đã lựa chọn đƣợc khoảng pH thích hợp nuôi cấy chủng B. licheniformis
BCRP để thu nhận enzym -amylaza là 6- 8 với pH tối ƣu là 7,5.
Nhƣ vậy chủng B20 có hoạt tính phân giải tinh bột ở dải pH 4,0- 8,0, nhƣng thích hợp là 6,0- 8,0. Tuỳ thuộc vật nuôi và điều kiện chăn nuôi khác nhau, chất thải chăn nuôi thƣờng có pH dao động trong khoảng từ 5 đến 8 nhƣng trƣớc khi ủ, cơ chất thƣờng đƣợc điều chỉnh về 6- 7. Do đó khoảng pH thích hợp của chủng vi khuẩn B20 hoàn toàn phù hợp với pH của chất thải chăn nuôi trong quá trình xử lý.
103 * Ảnh hưởng của ion kim loại
Phần lớn amylaza có hoạt tính và độ bền nhiệt phụ thuộc vào Ca2+ nhƣng ở mức độ khác nhau. Nuôi cấy chủng vi khuẩn B20 trong môi trƣờng dịch thể trên máy lắc ổn nhiệt ở 400C, tốc độ lắc 220 vòng/phút. Sau 48 giờ nuôi, thu dịch enzym thô, enzym đƣợc bổ sung CaCl2 với các nồng độ 2; 4 mM và đƣợc xử lý nhiệt ở 85oC trong 15 và 30 phút. Mục đích của nghiên cứu là xác định ảnh hƣởng của ion Ca2+ trong môi trƣờng tới hoạt tính amylaza của chủng vi khuẩn B20.
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng ion Ca2+ đến độ bền nhiệt của amylaza do chủng B20 tổng hợp
Nồng độ Ca++
(mM) Thời gian xử lý (phút)
Hoạt tính tƣơng đối (%)
0 15 21,2 30 4,5 2 15 92,2 30 29,5 4 15 40,3 30 20,5
Kết quả thử nghiệm cho thấy khi không có ion Ca2+ hoạt tính amylaza giảm nhanh, sau 15 phút xử lý nhiệt ở 850C hoạt tính tƣơng đối là 21,2%, sau 30 phút xử lý nhiệt hoạt tính gần nhƣ bị mất, hoạt tính tƣơng đối chỉ còn là 4,5%.
Độ bền nhiệt của amylaza tăng lên khi bổ sung ion Ca2+ vào dịch enzym thô, nồng độ Ca2+ bổ sung khác nhau sẽ có mức ảnh hƣởng khác nhau đến hoạt tính của enzym. Sau 15 phút xử lý nhiệt 850C hoạt tính tƣơng đối vẫn đạt 92,2% khi bổ sung Ca2+ 2 mM và cao hơn nhiều khi bổ sung Ca2+ 4 mM (đạt 40,3 mg/l).
Thời gian xử lý cũng ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính amylaza. Sau khi xử lý 30 phút ở nhiệt độ 850C, khi có mặt ion Ca2+ ở cả 2 nồng độ 2 mM và 4 mM thì hoạt tính tƣơng đối đều giảm ở mức thấp (lần lƣợt là 29,5% và 20,5%).
Trong thử nghiệm này, nồng độ Ca2+ thích hợp là 2 mM trong thời gian xử lý nhiệt là 15 phút. Kết quả nghiên cứu khá phù hợp với kết quả nghiên cứu của
104
Nguyễn Thị Hoài Hà [7] và của Kwak và Akiba [82], các tác giả này cho rằng ion Ca2+ làm ổn định cấu trúc bậc III của enzym amylaza khi ở nhiệt độ cao và không thể thay thế bằng các ion kim loại khác.
Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy chủng vi khuẩn B20 có khả năng tổng hợp enzym phân giải tinh bột trong điều kiện nhiệt độ 30-550C, pH 4,0-8,0, khoảng nhiệt độ thích hợp là 37- 500C; pH 6,0- 8,0. Sự có mặt của ion Ca2+ làm tăng hoạt tính và độ bền nhiệt của amylaza được tổng hợp bởi chủng vi khuẩn B20.