Các xét nghiệm sinh hóa ựược mô tả bởi Lelliott và Stead (1987), Schaad (1988) và Toth và cộng sự (2002). Các xét nghiệm này ựược tiến hành trên môi trường vô trùng trong vòng 48 giờ trên các môi trường dinh dưỡng. Sự phát triển trong các ựiều kiện nhiệt ựộ khác nhau trên môi trường CVP cũng có thể giúp phân biệt các loài phụ của Erwinia carotovora. Nếu như Erwinia carotovora
subsp. atroseptica phát triển mạnh ở nhiệt ựộ 270C thì Erwinia carotovora
subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi phát triển mạnh và tạo thành hố trên bề mặt môi trường ở nhiệt ựộ tương ứng là 33,5 và 370C [25, 26, 33].
Việc phân lập vi khuẩn thối nhũn Erwinia carotovora từ các mô bị bệnh, nước và ựất có thể tiến hành bằng cách sử dụng các môi trường chọn lọc. Một số một trường ựã ựược miêu tả nhưng hiệu quả và ựơn giản nhất là môi trường với các tinh thể tắm (Hyman và cộng sự, 2001). Trên môi trường này, sau 48 giờ ủ ở nhiệt ựộ 270C, loài vi khuẩn thối nhũn Erwinia carotovora
hình thành khuẩn lạc óng ánh, xuất hiện các ựiểm lõm sâu.
Việc hòa loãng dịch ựể phân lập trên CVP ựược chuẩn bị sau khi loại bỏ một mảnh mô tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe. Việc phân lập Erwinia carotovora gặp khó khăn vì trên vết bệnh thường có các loại vi sinh vật hoại sinh. Nếu phân lập từ thân cây bị bệnh, lớp biểu bì sẽ ựược tước bỏ tại ựường giao nhau giữa mô bệnh và mô khỏe, lấy phần mô bị thối nhũn và dầm nát
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 18
trong nước cất vô trùng. Khuẩn lạc của vi khuẩn Erwinia carotovora không tạo
huỳnh quang trên môi trường King B trong khi hầu hết các loài Pseudomonas
có tạo huỳnh quang. để xác ựịnh một loài là Erwinia carotovora cần phải có các dấu hiệu sau ựây: phản ứng catalase dương tắnh, âm tắnh với phản ứng oxy hóa, lên men chuyển hóa và làm thối lát cắt củ khoai tây.
Việc chẩn ựoán nhanh vi khuẩn Erwinia carotovora bằng kỹ thuật hiện ựại không thể thực hiện ựược nếu không có kháng thể và mồi PCR ựặc hiệu. Tuy nhiên, có thể phân biệt ựược sự khác biệt giữa Erwinia carotovora subsp.
atroseptica và Erwinia chrysanthemi bằng cách tiến hành ựồng thời hai phản ứng PCR có sử dụng một tập hợp các ựoạn mồi cho phép phát hiện hầu hết các phân loài Erwinia carotovora bao gồm cả Erwinia carotovora subsp.
carotovora và Erwinia carotovora subsp. atroseptica nhưng không phát hiện ựược Erwinia chrysathemi [11] mà cụ thể trên khoai tây là loài Erwinia carotovora subsp. Atroseptica [41].
Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora bằng nhiều phương pháp khác nhau.Với sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử ra ựời như PCR (Polymerase Chain Reaction), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),Ầ ựã tạo nên một sự chuyển biến mới trong công tác bảo vệ thực vật.
Một nhóm các nhà nghiên cứu Thái Lan sử dụng phương pháp PCR ựể phát hiện và phân loại vi khuẩn gây bệnh thối nhũn Erwinia trên thực vật. Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 ựể khuếch ựại ựoạn 434 bp trong
khung ựọc mở (open reading frame) của pectate lyase (Pel) gen của Erwinia
carotovora, cặp primer ADE1và ADE2 ựể khuếch ựại ựoạn 420 bp trong
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 19
có cặp primer Y1 và Y2 khuếch ựại ựược ựoạn gen mong muốn của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập ựược [31].
Darrasse và ctv, (1994) sử dụng phương pháp PCR Ờ RFLP trên gen pel (mã hóa pectate lyases) ựể xác ựịnh mối quan hệ giữa Erwinia carotovora với bệnh trên cây khoai tây. Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 cho phép
khuếch ựại một ựoạn 434 bp của những dòng Erwinia carotovora. Trong 89
dòng Erwinia carotovora ựược kiểm tra, chỉ những dòng Erwinia carotovora
subsp. betavasculorum là không phát hiện thấy. RFLP ựược thực hiện trên ựoạn ựược khuếch ựại với 7 enzyme endonuclease: TaqI, HaeIII, HhaI, AluI,
HaeII, Sau3AI, HpaII thì thấy có sự ựa hình giữa các dòng [11].
Seo và ctv (2001) ựã sử dụng phương pháp PCR Ờ RFLP nghiên cứu về kiểu hình và ựa dạng di truyền trên 87 dòng vi khuẩn Erwinia carotovora ssp.
carotovora (Ecc) phân lập từ các cây kắ chủ khác nhau ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Thái Lan. Thắ nghiệm tiến hành phân tắch PCR Ờ RFLP của gen 16S ribosomol DNA (rDNA) với cặp primer fD1 và rP2, 16S Ờ 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs) với cặp primer R16 - 1, R23 Ờ 2R, gen pel
mã hóa pectate lyase với cặp primer Y1và Y2. Bằng phân tắch RFLP trên sản phẩm khuếch ựại với các enzyme cắt giới hạn HinfI, MboI, Sau3AI, kết quả cho thấy sự ựa hình giữa các dòng nghiên cứu. Năm 2003, nhóm các nhà nghiên cứu này cũng ựã sử dụng phương pháp PCR Ờ RFLP và RAPD ựể nghiên cứu về mặt kiểu hình và ựặc tắnh di truyền của vi khuẩn Erwinia carotovora trên cây dâu tằm (mulberry) (Morus spp.). Thắ nghiệm ựược tiến hành trên 9 dòng vi khuẩn ựược phân lập từ cây dâu tằm [34].
Bằng phương pháp thử các phản ứng sinh hóa, những dòng vi khuẩn này ựược chia thành 2 loại: type 1 và type 2. Hai dòng thuộc type 1 giống với Ecc trong khi 7 dòng thuộc type 2 thì khác biệt với Ecc. Bằng nghiên cứu qua nhiều giai ựoạn bao gồm thử nghiệm huyết thanh học (serological assay),
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 20
PCR chuyên biệt cho Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), PCR Ờ RFLP với pectate lyase (Pel) gen và PCR Ờ RAPD cho thấy những dòng vi
khuẩn thuộc type 2 thuộc về những nhóm phụ Erwinia carotovora khác hơn
là Ecc và Eca. Fiori và Schiaffino (2003) cũng sử dụng phương pháp PCR Ờ
RFLP ựể nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu (Capsicum
annuum L.): Erwinia carotovora subsp. carotovora tại các nhà kắnh ở Sardinia, Italia. Phản ứng PCR với cặp mồi Y1 và Y2 cho phép khuếch ựại một trình tự có kắch thước 434bp. Phân tắch RFLP trên sản phẩm PCR ựược tiến hành với 4 enzyme endonuclase giới hạn AluI, HaeII, HpaII, Sau3AI thì thấy có sự ựa hình giữa các dòng.
Các nhà khoa học trường ựại học Cambridge ựã có một khám phá then chốt về gen của vi khuẩn gây ra bệnh thối cây, một loại bệnh ở khoai tây gây thiệt hại về kinh tế và khám phá này có thể ựưa ựến các phương pháp mới ựể chống lại căn bệnh này. Họ phát hiện ra rằng, nếu làm cho một gen cụ thể
không hoạt ựộng trong vi khuẩn Erwinia carotovora thì khả năng làm hư cây
và gây bệnh ở cây của vi khuẩn này sẽ bị cản trở rất nhiều.
Vi khuẩn Erwinia carotovora ựược biết ựến nhiều nhất ở các vùng ôn
ựới vì gây ra bệnh chết khô và bệnh thối ướt ở khoai tây. Sự gây bệnh ựược thực hiện do vi khuẩn có thể sản xuất ra các enzyme làm phá vỡ các thành tế bào của cây chủ. Thành tế bào bị phá vỡ cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn này và vì thế hỗ trợ sự tồn tại và phát triển của nó.
Các nhà khoa học Cambridge phát hiện ra rằng, nếu làm cho một gen không hoạt ựộng gọi là gen re1A, gen giúp vi khuẩn nhận ra khi nào chất dinh dưỡng ựang ắt ựi, thì khả năng sản xuất ra enzyme của nó ựể phá thành tế bào của cây chủ cũng sẽ ựược phá huỷ ựi.
Chủ nhiệm nghiên cứu - tiến sĩ Martin Welch giải thắch: ỘBệnh thối cây là một vấn ựề kinh tế quan trọng, về cơ bản làm giảm sản lượng thu hoạch. Chúng tôi ựã chứng minh ựược rằng, việc tạo ra các enzyme phá hủy thành tế
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
bào có liên quan về mặt di truyền chẳng những với khả năng phát tắn hiệu mà còn ở trạng thái dinh dưỡng của vi khuẩn. điều này có ý nghĩa quan trọng cho các nhà khoa học trong việc tìm ra các phương pháp mới ựề phòng và chống căn bệnh này. Bằng cách cải thiện hiểu biết của chúng ta về cách mà vi khuẩn Erwinia carotovora làm thối cây, chúng ta có thể khám phá thêm các phương pháp mới lạ ựể phát triển các tác nhân chống thối câyỢ