Việc kiểm soát vi khuẩn gây bệnh thối nhũn gặp rất nhiều khó khăn vì tác nhân gây bệnh thường tồn tại và ựược bảo vệ trong những mắt củ, lỗ vỏ cây hóa bần, do ựó chúng không bị tác ựộng bởi các dung dịch khử trùng. Hơn nữa, vi khuẩn Erwinia carotovora dễ dàng lan rộng ra môi trường xung quanh.
Theo Reene Miller (2011), những ựiều sau ựây cần ựược chú ý ựể làm giảm thiệt hại cho củ hành trong bảo quản. Cụ thể, cần chú ý những ựiều sau:
- Áp dụng các loại thuốc trừ sâu dạng hạt trong quá trình trồng ựể kiểm soát các loài côn trùng như giòi hành mà chúng có thể vừa gây ra vết thương vừa truyền vi khuẩn và gây ra hậu quả là làm thối nhũn củ hành.
- Hạn chế các vết dập và vết thương cơ giới trên cây hành trong suốt quá trình thu hoạch và xử lý. Những cây bị thương là những cây có khả năng bị bệnh thối nhũn cao nhất.
- Cắt ựứt rễ hành khi nhổ hành lên khỏi mặt ựất ựể ựẩy nhanh việc làm khô lá và cổ củ hành.
- Luân canh trong vòng 3 năm với các loại cây trồng kháng bệnh thối nhũn như các loại ngủ cốc ựể hạn chế các tác nhân gây bệnh này từ ựất.
- Phun các loại thuốc trừ vi khuẩn có gốc ựồng hai tuần trước giai ựoạn vào củ ựể kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn gây thối rễ. Các cơn bão có thể là nguyên nhân gây ra các vết thương trên lá và trên củ hành. Nếu các thuốc trừ vi khuẩn có gốc ựồng ựược phun lên các lá và củ ựã bị các vết thương cơ giới trong nhiều giờ, sự phát triển của vi khuẩn có thể bị giảm mạnh. Vẫn có các triệu chứng của bệnh thối nhũn xảy ra, tuy nhiên, sự ảnh hưởng của nó là không lớn.
- Tiếp tục phun thuốc ựịnh kỳ 1 tuần ựến 10 ngày. Chú ý tuân thủ các hướng dẫn ghi trên nhãn mác, và trong ựiều kiện khô, bổ sung nước cho ựủ ựể bảo ựảm hiệu quả diệt khuẩn của các loại thuốc trừ vi khuẩn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
- Tránh tưới roa khi hành bắt ựầu vào củ, nó có thể làm cho hành phát triển thành hai vòng ựường kắnh cổ của củ hành. Nước có thể làm lây lan vi khuẩn tới các củ hành không bị nhiễm bệnh và lây lan qua ựất.
- Cắt củ hành khoảng 1,3 cm bên trên cổ củ hành khi thu hoạch ựể ngăn chặn khả năng bị dập và tránh các vết thương cho củ hành.
- Thu hoạch hành chỉ khi các củ ựã phát triển ựầy ựủ ựể bảo ựảm cổ củ hành ựã khô, nó sẽ giúp tạo ra một rào cản ựể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn sau thu hoạch.
- để hành ở nơi thoáng khắ cho ựến khi cổ của củ hành ựược làm khô trước khi chúng ựược ựưa vào bảo quản.
- Loại bỏ bất kỳ củ hành nào có những biểu hiện của việc bị dập hoặc những vết thương khác trước khi bảo quản ựể chống lại bệnh thối nhũn vi khuẩn có thể tồn tại trên những củ này rồi từ ựó lây lan sang các củ khỏe.
- Bảo quản củ hành sau khi thu hoặc ở ựiều kiện từ 0 ựến 20C và ựiều kiện ựộ ẩm duy trì thấp hơn 70%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
PHẦN III
VẬT LIỆU, đỊA đIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Các giống hành tắm và hành trắng ựang ựược trồng tại Kinh Môn Ờ Hải Dương. - Các mẫu củ hành bị thối nhũn trong sản xuất và trong bảo quản
- Dụng cụ: Chậu vại, hộp nhựa có nắp ựậy, panh kẹp, xilanh, cốc ựong, bình tam giác, trang thủy tinh, que cấy, ựĩa petri, dao cắt loại nhỏ, Ầ
- Thiết bị máy móc: Buồng cấy, kắnh hiển vi quang học, kắnh soi nổi, tủ ựịnh ôn, nồi hấp, máy ảnh, máy tắnh, Ầ
- Hóa chất: MgCl2, Dextrone, glucose, cồn, agar, nước cất, peptone, Ầ - Một số loại thuốc bảo vệ thực vật dùng trong phòng trừ vi khuẩn gây bệnh
3.2. Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu
* Thời gian nghiên cứu: từ tháng 07/2011 ựến tháng 06 năm 2012 * địa ựiểm nghiên cứu
- Huyện Kinh Môn Ờ Hải Dương
- Bộ môn Miễn Dịch Thực vật - Viện Bảo vệ thực vật
- Bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học - Trường ựại học Nông nghiệp Hà Nội
3.3. Nội dung nghiên cứu
* điều tra thành phần bệnh hại trên cây hành trong sản xuất và củ hành trong bảo quản tại huyện Kinh Môn, Hải Dương.
* điều tra diễn biến một số bệnh hại chắnh trong bảo quản và bệnh thối nhũn hành ngoài sản xuất tại huyện Kinh Môn, Hải Dương.
* Phân lập các tác nhân gây bệnh thối nhũn trên hành, xác ựịnh nguyên nhân gây hại chắnh.
* Nghiên cứu ựặc ựặc tắnh sinh lý của vi khuẩn Erwinia carotovora * Nghiên cứu ựặc ựiểm dịch tễ học của vi khuẩn Erwinia carotovora
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các mức bón ựạm khác nhau ựến bệnh thối nhũn
* Thử nghiệm một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh thối nhũn hành trong phòng thắ nghiệm và trong sản xuất.
* Nghiên cứu khả năng ựối kháng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis với vi khuẩn Erwinia carotovora trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp ựiều tra thành phần bệnh hại hành
- điều tra theo Quy chuẩn Việt Nam năm 2010 (QCVN 01-38 :
2010/BNNPTNT) [1]
- điều tra thành phần bệnh hại hành trên ựồng ruộng huyện Kinh Môn, tỉnh Hải Dương theo 5 ựiểm chéo góc mỗi ựiểm chọn 2m2.
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh
Số khóm (củ, lá) bị bệnh Tỷ lệ bệnh (%) =
Tổng số khóm (củ, lá) ựiều tra x 100%
3.4.2. điều tra diễn biến bệnh thối nhũn hành trong sản xuất và bảo quản
- Trong sản xuất, ựiều tra theo phương pháp 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm ựiều tra 2 m2, ựịnh kỳ ựiều tra 7 ngày 1 lần.
- Trong bảo quản, ựiều tra 3 tầng, mỗi tầng 5 ựiểm, mỗi ựiểm ựiều tra ắt nhất 100 củ, ựiều tra ựịnh kỳ 7 ngày 1 lần và ghi lại kết quả.
- Chỉ tiêu theo dõi:
Số khóm (củ) bị bệnh Tỷ lệ bệnh (%) =
Tổng số khóm (củ) ựiều tra x 100%
3.4.3. Phân lập các tác nhân gây bệnh thối trên hành
Theo Nguyễn Văn Tuất (2002): Dựa vào triệu chứng bệnh trên ựồng ruộng, mẫu ựược thu thập về phòng thắ nghiệm và phân lập theo phương pháp của Viện BVTV ựể phân lập và giám ựịnh các vật gây bệnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Một số bệnh quan trọng hại hành và không xuất hiện thường xuyên sẽ ựược kiểm chứng tên khoa học và triệu chứng bệnh theo chu trình Kock.
Các bước theo chu trình Kock bao gồm: Thu mẫu bệnh ngoài tự nhiên
Phân lập mẫu bệnh trên môi trường nuôi cấy nhân tạo hoặc thu bào tử từ các vết bệnh.
Lây nhiễm nhân tạo trên cây trồng
Chăm sóc cây trồng và quan sát sự hình thành vết bệnh trên cây, khi có triệu chứng bệnh xuất hiện, tiến hành phân lập lại và so sánh với triệu chứng và mô tản nấm hoặc vi khuẩn có giống với triệu chứng bệnh ban ựầu ựể khẳng ựịnh vật gây bệnh là ựúng.
* Thử phản ứng trên lát cắt củ khoai tây
Dùng hộp peptri ựã ựược khử trùng có lót giấy lọc Watsman. Khoai tây
ựược rửa sạch bằng nước cất, rửa lại bằng cồn 700 sau ựó dùng dao ựã ựược
khử trùng cắt khoai tây thành các lát mỏng 5 mm ựặt vào ựĩa petri sau ựó cấy vi khuẩn lên trên bề mặt lát cắt củ khoai tây. Cất trong tủ ựịnh ôn giữ ở ngưỡng nhiệt ựộ là 280C và quan sát phản ứng trên lát cắt sau 24, 48, 72h.
* Xác ựịnh khả năng của vi khuẩn làm mủn tế bào cây
Rót 5ml dịch khuẩn ựã cấy ựược 5 Ờ 6 ngày vào một ựĩa nhỏ, thả vào ựó những lát tế bào cây ựược cắt bằng lưỡi lam. đậy ựĩa lại và ựặt trong tủ
ựịnh ôn giữ ở nhiệt ựộ 300C. Sự hóa mủn thể hiện qua hiện tượng các mảnh
nhỏ bị tách khỏi lát cắt khi chạm nhẹ bằng kim. Khi quan sát những lát cắt dưới kắnh hiển vi có thể thấy rải rác các tế bào nhu mô. Vi khuẩn Erwinia carotovora làm mủn các lát cắt trong vòng 30 phút.
* Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia carotovora ở một số nồng ựộ khác nhau.
Vi khuẩn Erwinia carotovora nuôi cấy trên môi trường PDA sau 2 ngày ựược hòa tan trong nước cất. Pha các dung dịch vi khuẩn Erwinia
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
carotovora thành các nồng ựộ khác nhau, các nồng ựộ hơn kém nhau 10 lần, mỗi nồng ựộ pha 150 ml dung dịch. Trước khi pha cần xác ựịnh nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora.
Dùng phương pháp so màu bằng máy Spectrophotometer ở bước sóng ánh sáng 600 nm ựể xác ựịnh nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora.
Cách pha các dung dịch vi khuẩn Erwinia carotovora với các nồng ựộ
khác nhau: Lấy 15 ml dịch vi khuẩn ban ựầu ựã xác ựịnh nồng ựộ bằng phương pháp ở trên cho vào cốc ựong, thêm nước cất vào cho ựến khi ựủ 150 ml và khuấy ựều ta ựược dung dịch thứ nhất có mật ựộ vi khuẩn giảm 10 lần so với dung dịch ban ựầu. Tiếp tục lấy 15 ml ở dung dịch thứ nhất cho vào cốc ựong thứ hai, thêm nước cất cho ựến khi ựủ 150 ml và khuấy ựều ta ựược dung dịch thứ hai với nồng ựộ thứ hai. Lặp lại quá trình trên cho ựến khi ựủ các nồng ựộ cần pha.
Tạo các dung dịch vi khuẩn Erwinia carotovora với các nồng ựộ 2x108, 2x107, 2x106, 2x105, 2x104 và 2x103 cfu/ml, dùng nước cất làm ựối chứng. Mỗi nồng ựộ dung dịch này ựược lây nhiễm trên 40 củ hành khỏe của giống hành trắng bằng cách ngâm chúng trong các dung dịch Erwinia carotovora
với nồng ựộ tương ứng trong thời gian 5 phút, sau ựó vớt ra ựể khô và cho vào các hộp nhựa riêng rẽ. Theo dõi hàng ngày sự xuất hiện của bệnh và ựếm số củ bị bệnh thối nhũn ở các công thức sau 10 ngày lây nhiễm.
3.4.4. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Lấy vi khuẩn Erwinia carotovora ựã phát triển trên ựĩa petri chứa môi trường PDA sau 2 ngày nuôi cấy ựể hòa tan vào nước cất. Dùng phương pháp so màu ựể xác ựịnh nồng ựộ vi khuẩn thắch hợp cho các thắ nghiệm lây bệnh. Những củ hành có vết thương và không có vết thương ựược ngâm trong các cốc riêng biệt ựựng dung dịch Erwinia carotovora trong thời gian 5 phút. Lấy các củ hành ra khỏi dịch vi khuẩn và ựể khô trước khi ựưa vào các hộp ựựng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Phương pháp tạo vết thương cơ giới: Loại bỏ bớt lớp vỏ hành ngoài
cùng, khử trùng bằng cồn 700 sau ựó ựể khô. Dùng dao nhỏ nhọn ựầu ựã ựược
khử trùng tạo thành những vết châm trên bề mặt củ hành.
3.4.5. Thử khả năng ựối kháng của một số vi sinh vật với Erwinia carotovora
* Thắ nghiệm nghiên cứu khả năng ựối kháng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis với vi khuẩn Erwinia carotovora.
Dùng khoai tây thương phẩm. Sau khi ựược rửa sạch bằng nước máy và làm khô trên khăn giấy, củ khoai tây ựược khử trùng bề mặt với ethanol 70% và sau ựó thái lát ựều với ựộ dày 5 mm. Trước khi xử lý, lát khoai tây ựược nhúng vào hệ dung dịch Bacillus thuringiensis hoặc các chủng vi khuẩn khác ở nồng ựộ 2 x 108 cfu/ml trong khoảng 20 giây. Sử dụng nước cất làm ựối chứng. Lát khoai tây ựược xử lý sau ựó sấy khô trong tủ cấy khoảng 20 phút ựể làm giảm ựộ ẩm bề mặt trước lây nhiễm với 2,5 ộl dung dịch vi khuẩn
Erwinia carotovora ở các nồng ựộ khác nhau. đối với trường hợp xử lý kết hợp, một khối lượng tương ựương nhau của các vi sinh vật ựối kháng ựược
trộn lẫn với dung dịch vi khuẩn Erwinia carotovora như ựã nêu. Bề mặt cắt
của các lát khoai tây ựược lây nhiễm bằng 2,5 ộl hỗn hợp. Tất cả các lát khoai tây ựã xử lý ựược ựặt trong ựĩa petri ựược phủ và ủ ở nhiệt ựộ 280C. Vùng bị
thối ướt (ựo bằng mm2) ựược ựo tại các thời ựiểm quy ựịnh. Mỗi công thức
ựược lặp lại từ 4 ựến 12 lần, và mỗi lần lặp lại ựược sử dụng ựể tiến hành lây nhiễm ở 3 ựiểm trên mỗi lát khoai tây [16].
3.4.6. Phương pháp nghiên cứu ngoài ựồng ruộng
* Thắ nghiệm xác ựịnh ảnh hưởng của lượng ựạm bón ựến bệnh thối nhũn hành Thắ nghiệm ựược tiến hành với giống hành trắng trên nền phân bón tắnh cho 1 ha là: 5 tấn phân chuồng + 300 kg tro bếp + 280 kg super lân + 80 kg kali. Thắ nghiệm ựược bố trắ theo kiểu khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh gồm 5 công thức khác nhau về lượng ựạm bón và mỗi công thức ựược nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại ựược bố trắ trong ô hình chữ nhật với diện tắch 20 m2/ô.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Các mức ựạm bón tương ứng với mỗi công thức như sau: Công thức 1: 100 kg ựạm/ha (200 gram/ ô 20 m2) Công thức 2: 110 kg ựạm/ha (220 gram/ ô 20 m2) Công thức 3: 125 kg ựạm/ha (250 gram/ ô 20 m2) Công thức 4: 140 kg ựạm/ha (280 gram/ ô 20 m2) Công thức 5: 150 kg ựạm/ha (280 gram/ ô 20 m2) Sơ ựồ thắ nghiệm:
100 kg 110 kg 140 kg 125 kg 150 kg
110 kg 150 kg 100 kg 140 kg 125 kg
150 kg 125 kg 110 kg 100 kg 140 kg
- Theo dõi diễn biến bệnh thối nhũn trên các công thức thắ nghiệm ựịnh kỳ 7 ngày 1 lần, ghi lại kết quả và tắnh tỷ lệ bệnh. Các khóm bị bệnh sẽ ựược nhổ bỏ và số khóm bị bệnh ở mỗi ô sẽ ựược cộng dồn qua các lần ựiều tra.
- Cân năng suất ô thắ nghiệm ở các công thức với các lần nhắc. - Chỉ tiêu theo dõi:
Số khóm (củ) bị bệnh Tỷ lệ bệnh (%) =
Tổng số khóm (củ) ựiều tra x 100%
* Nghiên cứu ảnh hưởng của giống hành ựến bệnh thối nhũn
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 2 giống hành hiện ựược trồng ở Kinh Môn Ờ Hải Dương là giống Hành trắng và Hành tắm. Tiến hành theo dõi ựịnh kỳ hàng tuần trên hai giống hành, mỗi giống hành theo dõi 5 ựiểm cố ựịnh, mỗi ựiểm 5m2. Ghi lại kết quả và tắnh tỷ lệ bệnh sau mỗi kỳ ựiều tra.
5 m
4
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
3.4.7. Nghiên cứu một số biện pháp phòng trừ bệnh thối nhũn hành
* Khảo sát hiệu lực của một số thuốc hóa học trong phòng chống vi khuẩn Erwinia carotova trên môi trường PDA
Dùng vi khuẩn Erwinia carotovora ựã ựược cấy trên môi trường PDA 2
ngày. Lượng môi trường dùng cho mỗi công thức thuốc là 200 ml ựược ựựng trong các bình tam giác. Cho thuốc vào môi trường khi nhiệt ựộ môi trường còn 40 Ờ 450C theo lượng khuyến cáo và lắc cho thuốc tan ựều.
Công thức 1: đối chứng (không dùng thuốc)
Công thức 2: Kamsu 2L (hòa tan 0,4 ml thuốc trong 200 ml môi trường) Công thức 3: Ksumin 2L (hòa tan 0,6 ml thuốc trong 200 ml môi trường) Công thức 4: New Kasuran 16.6WP (0,5 gram thuốc/200 ml môi trường) Chỉ tiêu theo dõi: đường kắnh khuẩn lạc ở các thời ựiểm 24, 36, 48, 60 và 72 giờ sau cấy.
* Khảo sát hiệu lực của một số loại thuốc hóa học trừ bệnh thối nhũn trên hành trong ựiều kiện ựồng ruộng.
- Thắ nghiệm ựược bố trắ theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh với 3 lần nhắc lại, mỗi ô có diện tắch 20 m2, gồm các công thức sau: