2.2.9.1. Một số nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus subtilis
Tên ban ựầu của vi khuẩn này là Vibriosubtilis năm 1835, Vi sinh vật ựã ựược ựặt lại tên thành Bacillus subtilis vào năm 1872. Những tên khác cho vi khuẩn này bao gồm Bacillus uniflagellatus, Bacillus globigii và Bacillus natto. Vi khuẩn Bacillus subtilis là một trong những vi khuẩn ựầu tiên ựược nghiên cứu. Những vi khuẩn này là mô hình tốt cho sự phát triển tế bào và sự khác biệt. (Entrez Genome Project).
Bacillus subtilis là vi khuẩn hình que, vi khuẩn gram dương có thể ựược tìm thấy tự nhiên trong ựất và thảm thực vật. Bacillus subtilis phát triển trong khoảng nhiệt ựộ tối ưu như các vi sinh vật khác là từ 20 ựến 400C, trong ựó nhiệt ựộ tối thắch là từ 25 ựến 350C (Entrez Genome Project). Áp suất lớn và sự nghèo dinh dưỡng là tình trạng phổ biến trong ựiều kiện môi trường này, do ựó,
Bacillus subtilis ựã hình thành nên một loạt các chiến lược ựể có thể cho phép nó tồn tại trong ựiều kiện khắc nghiệt này. Một chiến lược, vắ dụ như, hình thành nên các nội bào tử chống lại áp lực.
Một chiến lước khác là sự hấp thu của DNA bên ngoài, nó cho phép vi khuẩn thắch nghi bằng cách tái tổ hợp. Mặc dù vậy, những chiến lược này ựòi hỏi nhiều thời gian. Bacillus subtilis cũng có thể ựược bảo vệ một cách nhanh hơn chống lại nhiều yếu tố gây áp lực như axit, kiềm, sự thẩm thấu, ựiều kiện oxy hóa, và nhiệt ựộ hoặc cồn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
Vi khuẩn Bacillus subtilis dòng SO113 tiết ra enzyme pectate liase nhiều nhất trong pha sinh sản theo cấp số nhân trong chu kỳ sinh trưởng của chúng, ngay trước khi hình thành bào tử mới. Enzyme pectate lyase ngoại bào này, sản sinh ra các sản phẩm không bão hòa từ Polygalacturonate ựã ựược làm sạch 35 lần so với bề mặt nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis nhờ máy sắc ký Sephadex CM. điểm ựẳng ựiện của dịch vi khuẩn này vào khoảng 9,6. Khả năng hoạt ựộng tối ưu của vi khuẩn diễn ra ở pH = 8,4 và nhiệt ựộ là 420C. Canxi có tác dụng kắch thắch và ựẩy mạnh sự hoạt ựộng của enzyme trong khi EDTA dẫn ựến bất hoạt enzyme. Pectate lyase có hoạt ựộng ựặc trưng ở ựộ 131 ml/lắt của các nhóm andehit trong 1 phút với mỗi mg protein. Bằng cách sử dụng kháng thể ựơn dòng ựể phản ứng lại với enzyme pectate lyase của vi khuẩn Erwinia chrysanthemi 3937, nó ựã chỉ ra rằng Pectate lyases loại b và c của dòng này có tắnh miễn dịch liên quan chặt chẽ với enzyme pectate lyase của vi khuẩn Bacillus subtilis [27].
Các chất kháng khuẩn ựược sản xuất bởi vi khuẩn Bacillus subtilis BS 107 trong môi trường xác ựịnh và phân lập từ dịch lọc trên ựĩa nuôi cấy bằng nước chảy ở pH = 2,5. Phần nhỏ hoạt ựộng ựược trắch xuất trong ethyl acetate, acetone và ethanol 80% và tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên gel silica ựược pha với hỗn hợp ethanol nước với tỷ lệ 2:1 về thể tắch. Trong mỗi trường hợp, một băng có Rf là o,75 hình thành một vùng ức chế khi các tấm sắc ký mỏng (TLC) ựược ựặt tiếp xúc với môi trường thạch có chứa môi trường nuôi cấy Erwinia spp. Kháng sinh ựược tạo thành ở môi trường nuôi cấy trong giai ựoạn ựầu của sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis BS 107 nhưng một lượng lớn hơn ựã ựược tạo thành trong môi trường nuôi cấy cũ. Các khác sinh này có khả năng chống lại tác ựộng của các enzyme như nucleases, protease và lipase. Các enzyme này ổn ựịnh ngay cả khi hấp 2 lần trong thời gian 35 phút ở áp suất 2 atmosphere trong các môi trường axit, trung tắnh và kiềm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
Loại kháng sinh này vẫn hoạt ựộng trong phạm vi pH rộng từ 1 ựến 14 trong 1 tháng quan sát và ựược chứng minh là không bị giảm khả năng hoạt ựộng khi bảo quản ở nhiệt ựộ 40C trong hơn 1 năm. Bacillus subtilis BS 107 cho thấy khả năng hoạt ựộng trong ựiều kiện in vitro và in vivo chống lại vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. atroseptica và Erwinia carotovora subsp. carotovora Ờ các tác nhân gây có liên quan chặt chẽ và gây bệnh thối ướt trên khoai tây và một số loại cây trồng khác. Khả năng ựối kháng này thể hiện ở tác dụng làm giảm triệu chứng bệnh trên củ khoai tây [36].
Bệnh thối nhũn trên cây hoa Amorphophallus do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra. Các tác giả của một công trình nghiên cứu về loại bệnh này ựã xác ựịnh và mô tả một loại protein APn5 ựược phân lập từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BSn5 có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn
Erwinia carotovora. Loại protein APn5 ựược chiết xuất từ bề mặt môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis bằng cách kết tủa với ammonium sulfate với ựộ bão hòa tương ựối 30% và siêu lọc. Kết quả thử nghiệm loại protein APn5 chỉ ra rằng nó có khả năng ức chế với phổ vi sinh vật tương ựối hẹp, chủ yếu là ựối với các vi khuẩn gây bệnh thực vật. Loại protein này nhạy cảm với nhiệt ựộ cao và ựộ pH kiềm, tương ựối nhạy cảm với các enzyme tripsine, proteinase K và pronase E. Khả năng ựối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis
trong pha tăng trưởng là không ổn ựịnh, khả năng ựối kháng giảm dần trong pha tĩnh và cuối cùng sẽ biến mất [17].
Vi khuẩn Bacillus subtilis ựược phân lập từ ựất bằng kỹ thuật lắc, có nhiệm vụ sản xuất kháng sinh. Hoạt tắnh kháng sinh mạnh nhất ựã ựược nhận biết là chủng Bacillus subtilis MH-4. Kháng sinh hoạt ựộng tối ưu nhất ở nhiệt ựộ 370C và pH cơ bản là 8. Glycerol là nguồn các bon tối ưu và axit L-glutamic là nguồn nitơ tối ưu nhất cho Bacillus subtilis. Kháng sinh Bacitracin ựược xác ựịnh là có hiệu quả với các vi khuẩn gram dương [10]. Các loại kháng sinh khác mà Bacillus subtilis tạo ra là Polymyxin, difficidin, subtilin và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
mycobacillin. Polymyxin có tác dụng chống lại vi khuẩn gram âm trong khi difficidin có phổ tác ựộng rộng hơn [42].
2.2.9.2. Một số loài vi khuẩn khác có khả năng ựối kháng Erwinia carotovora
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis thường ựược coi là vi khuẩn có thể sản xuất kháng sinh ựể can thiệp vào các chức năng sinh học bình thường của vi sinh vật ựối kháng ựể ựạt lợi thế cạnh tranh. Kết quả nghiên cứu ựã chỉ ra rằng vi khuẩn Bacillus thuringiensis ức chế sự tồn tại và phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn phụ thuộc vào ựộc tắnh của tác nhân gây bệnh cây Erwinia carotovora
thông qua một hình thức ựối kháng mới, ựó là tắn hiệu cảm ứng. Erwinia carotovora sản xuất ra các phân tử tắn hiệu acyl-homoserine lactone (AHL) ựề ựiều chỉnh việc sản xuất ra kháng sinh và biểu hiện của gen ựộc, trong khi ựó các chủng Bacillus thuringiensis có AHL - lactonase, ựó là một enzyme có hoạt tắnh
mạnh giúp phân giải và làm giảm lượng AHL do Erwinia carotovora sản sinh
ra. Bacillus thuringiensis dường như không can thiệp vào sự phát triển bình thường của vi khuẩn Erwinia carotovora, ựúng hơn, nó xóa bỏ sự tắch tụ của các phân tử tắn hiệu AHL khi chúng tồn tại trong cùng một môi trường nuôi cấy. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis làm giảm ựáng kể tỷ lệ nhiễm Erwinia carotovora
cũng như làm giảm triệu chứng thối ướt khoai tây do các tác nhân khác nhau gây ra. Hiệu quả kiểm soát sinh học tương quan với khả năng sản xuất AHL- lactonase của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Trong khi tất cả 7 chủng Bacillus thuringiensis ựều sản sinh ra AHL - lactonase ựể chống lại sự xâm nhiễm và gây bệnh của Erwinia carotovora thì các loài vi khuẩn Bacillus fusiformis và các chủng Escherichia coli sản sinh rất hạn chế hoặc không sản sinh ra enzyme AHL-lactonase ựể làm giảm sự tắch tụ của các phân tử tắn hiệu AHL nên chúng có tác ựộng kiểm soát sinh học rất nhỏ. đột biến của gen aiiA Ờ gen mã hóa sản sinh enzyme AHL Ờ lactonase trong vi khuẩn Bacillus thuringiensis dẫn ựến giảm ựáng kể về hiệu quả kiểm soát sinh học của nó. Kết quả này cho thấy rằng cơ chế can thiệp vào tắn hiệu cảm ứng hiện nay trong các
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
hệ sinh thái tự nhiên có thể ựược khám phá như một ựường hướng mới của sự ựối kháng ựể phòng ngừa các bệnh hại thực vật do vi khuẩn gây ra [16].