Theo Nguyễn Văn Tuất (2002): Dựa vào triệu chứng bệnh trên ựồng ruộng, mẫu ựược thu thập về phòng thắ nghiệm và phân lập theo phương pháp của Viện BVTV ựể phân lập và giám ựịnh các vật gây bệnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Một số bệnh quan trọng hại hành và không xuất hiện thường xuyên sẽ ựược kiểm chứng tên khoa học và triệu chứng bệnh theo chu trình Kock.
Các bước theo chu trình Kock bao gồm: Thu mẫu bệnh ngoài tự nhiên
Phân lập mẫu bệnh trên môi trường nuôi cấy nhân tạo hoặc thu bào tử từ các vết bệnh.
Lây nhiễm nhân tạo trên cây trồng
Chăm sóc cây trồng và quan sát sự hình thành vết bệnh trên cây, khi có triệu chứng bệnh xuất hiện, tiến hành phân lập lại và so sánh với triệu chứng và mô tản nấm hoặc vi khuẩn có giống với triệu chứng bệnh ban ựầu ựể khẳng ựịnh vật gây bệnh là ựúng.
* Thử phản ứng trên lát cắt củ khoai tây
Dùng hộp peptri ựã ựược khử trùng có lót giấy lọc Watsman. Khoai tây
ựược rửa sạch bằng nước cất, rửa lại bằng cồn 700 sau ựó dùng dao ựã ựược
khử trùng cắt khoai tây thành các lát mỏng 5 mm ựặt vào ựĩa petri sau ựó cấy vi khuẩn lên trên bề mặt lát cắt củ khoai tây. Cất trong tủ ựịnh ôn giữ ở ngưỡng nhiệt ựộ là 280C và quan sát phản ứng trên lát cắt sau 24, 48, 72h.
* Xác ựịnh khả năng của vi khuẩn làm mủn tế bào cây
Rót 5ml dịch khuẩn ựã cấy ựược 5 Ờ 6 ngày vào một ựĩa nhỏ, thả vào ựó những lát tế bào cây ựược cắt bằng lưỡi lam. đậy ựĩa lại và ựặt trong tủ
ựịnh ôn giữ ở nhiệt ựộ 300C. Sự hóa mủn thể hiện qua hiện tượng các mảnh
nhỏ bị tách khỏi lát cắt khi chạm nhẹ bằng kim. Khi quan sát những lát cắt dưới kắnh hiển vi có thể thấy rải rác các tế bào nhu mô. Vi khuẩn Erwinia carotovora làm mủn các lát cắt trong vòng 30 phút.
* Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia carotovora ở một số nồng ựộ khác nhau.
Vi khuẩn Erwinia carotovora nuôi cấy trên môi trường PDA sau 2 ngày ựược hòa tan trong nước cất. Pha các dung dịch vi khuẩn Erwinia
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
carotovora thành các nồng ựộ khác nhau, các nồng ựộ hơn kém nhau 10 lần, mỗi nồng ựộ pha 150 ml dung dịch. Trước khi pha cần xác ựịnh nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora.
Dùng phương pháp so màu bằng máy Spectrophotometer ở bước sóng ánh sáng 600 nm ựể xác ựịnh nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora.
Cách pha các dung dịch vi khuẩn Erwinia carotovora với các nồng ựộ
khác nhau: Lấy 15 ml dịch vi khuẩn ban ựầu ựã xác ựịnh nồng ựộ bằng phương pháp ở trên cho vào cốc ựong, thêm nước cất vào cho ựến khi ựủ 150 ml và khuấy ựều ta ựược dung dịch thứ nhất có mật ựộ vi khuẩn giảm 10 lần so với dung dịch ban ựầu. Tiếp tục lấy 15 ml ở dung dịch thứ nhất cho vào cốc ựong thứ hai, thêm nước cất cho ựến khi ựủ 150 ml và khuấy ựều ta ựược dung dịch thứ hai với nồng ựộ thứ hai. Lặp lại quá trình trên cho ựến khi ựủ các nồng ựộ cần pha.
Tạo các dung dịch vi khuẩn Erwinia carotovora với các nồng ựộ 2x108, 2x107, 2x106, 2x105, 2x104 và 2x103 cfu/ml, dùng nước cất làm ựối chứng. Mỗi nồng ựộ dung dịch này ựược lây nhiễm trên 40 củ hành khỏe của giống hành trắng bằng cách ngâm chúng trong các dung dịch Erwinia carotovora
với nồng ựộ tương ứng trong thời gian 5 phút, sau ựó vớt ra ựể khô và cho vào các hộp nhựa riêng rẽ. Theo dõi hàng ngày sự xuất hiện của bệnh và ựếm số củ bị bệnh thối nhũn ở các công thức sau 10 ngày lây nhiễm.