khuẩn Erwinia carotovora trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm.
Trong thắ nghiệm thử khả năng ựối kháng của Bacillus thuringiensis với vi khuẩn Erwinia carotovora, chúng tôi dùng vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở nồng ựộ 2x108 cfu/ml và vi khuẩn Erwinia carotovora ở các nồng ựộ khác nhau bao gồm 2x108, 2x107, 2x106 và 2x105 cfu/ml.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, diện tắch vết lõm trên lát cắt khoai tây
gây ra bởi vi khuẩn Erwinia carotovora ở mỗi nồng ựộ khác nhau trong hai
trường hợp nhúng vào dịch vi khuẩn Bacillus thuringiensis và nhúng nước cất là khác nhau. Ở mọi thời ựiểm theo dõi, diện tắch vết lõm trong trường hợp
nhúng nước cất luôn lớn hơn ở công thức nhúng trong dịch vi khuẩn Erwinia
carotovora rất nhiều.
Ở các nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora khác nhau trong mỗi trường hợp trên, diện tắch vết lõm cũng khác nhau. Nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora càng cao thì diện tắch vết lõm tạo ra trên lát cắt khoai tây càng lớn và ngược lại, nồng ựộ càng nhỏ thì diện tắch vết lõm càng nhỏ. Ở nồng ựộ 2x108 cfu/ml trong trường hợp nhúng lát khoai tây vào nước cất trước khi cấy vi khuẩn Erwinia carotovora, diện tắch vết lõm ở thời ựiểm 72 giờ sau cấy là 167,4 mm2. Ở các nồng ựộ 2x105, 2x106 và 2x107 cfu/ml, diện tắch vết lõm trong ựiều kiện tương tự ở thời ựiểm 72 giờ sau cấy tương ứng là 145,4; 126,8 và 119,6 mm2. Trong trường hợp nhúng lát khoai tây trong dịch vi khuẩn
Bacillus thuringiensis trước khi cấy Erwinia carotovora, diện tắch vết lõm khoai tây tương ứng với các nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora từ cao xuống thấp ở thời ựiểm 72 giờ sau cấy tương ứng là 24,6; 20,4; 18,2 và 14,8 mm2. Các số liệu chi tiết diện tắch vết lõm trên lát cắt khoai tây gây ra do các
nồng ựộ khác nhau của vi khuẩn Erwinia carotovora ựược thể hiện qua bảng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 78
Bảng 4.18. Diện tắch vết lõm trên lát cắt khoai tây gây ra bởi các nồng ựộ khác nhau của vi khuẩn Erwinia carotovora
Diện tắch vết lõm (mm2) ở các thời ựiểm
24 giờ sau cấy 48 giờ sau cấy 72 giờ sau cấy
Nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora BT Nước cất BT Nước cất BT Nước cất 2 x 108 cfu/ml 21,8 79,2 23,6 137,8 24,6 167,4 2 x 107 cfu/ml 19,2 72,4 19,8 123,2 20,4 145,4 2 x 106 cfu/ml 16,6 71,2 17,6 116,0 18,2 126,8 2 x 105 cfu/ml 13,2 68,4 14,0 109,8 14,8 119,6
Ghi chú: BT: Bacillus thuringiensis nồng ựộ 2x108 cfu/ml
Hình 4.19 Ờ 4.22. đồ thị biểu diễn diện tắch vết lõm trên lát cắt khoai tây gây ra bởi vi khuẩn Erwinia carotovora ở các nồng ựộ khác nhau
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 79
Nghiên cứu về cơ chế ựối kháng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
ựối với Erwinia carotovora của Dong và cộng sự (2004) ựã chỉ ra rằng, trong tất cả 7 chủng Bacillus thuringiensis ựã phát hiện và ứng dụng cho ựến nay ựều có khả năng sản xuất ra enzyme AHL-lactonase có khả năng
hạn chế khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia carotovora và ựây là một
trong những phương thức ựối kháng mới trong thế giới vi sinh vật ựược phát hiện trong những năm gần ựây [16].
Từ các dẫn liệu trên, chúng ta có thể khẳng ựịnh rằng vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng ức chế nhất ựịnh khả năng gây bệnh của vi khuẩn
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 80
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Trong bảo quản phát hiện 5 loại bệnh hại: bệnh mốc ựen do nấm
Aspergillus niger, bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus, bệnh mốc xanh do nấm Penicillium spp., bệnh thối khô do nấm Fusarium sp. và bệnh thối
nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra. Ngoài ựồng ruộng, thành phần
bệnh hại bao gồm: bệnh khô ựầu lá do nấm Stemphyllium botryosum, bệnh sương mai hành do nấm Peronospora destructor, bệnh héo vàng do nấm
Fusarium sp. và bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora trong ựó bệnh khô ựầu lá là phổ biến nhất và bệnh héo vàng có tỷ lệ bệnh thấp nhất.
- Thiệt hại về năng suất do các loại bệnh hại gây ra trong bảo quản hành năm 2011 tại Kinh Môn Ờ Hải Dương là 12,45% trong ựó bệnh thối nhũn hành chiếm tỷ lệ 4,30%. Phương pháp bảo quản hành bằng cách treo gác bếp có tỷ lệ bệnh tổng số là 6,86% - thấp hơn hai phương pháp bảo quản còn lại là bảo quản bằng cách làm giàn và tủ ựống rơm với tổng tỷ lệ bệnh hại tương ứng là 10,43% và 12,45%.
- Tác nhân gây bệnh thối nhũn hành là loài Erwinia carotovora. Vi khuẩn này có khả năng làm mủn mô tế bào thực vật, tạo màu ựỏ huyết dụ trên môi trường TZC, khuẩn lạc có dạng tròn, trơn, nhẵn, có khả năng gây bệnh thối nhũn trên quả cà chua.
- Thời gian tồn tại của vi khuẩn Erwinia carotovora trong nước cất là 52 Ờ 54 ngày, trong nước lã là 26 Ờ 28 ngày, trong ựất có khử trùng là 92 Ờ 96
ngày và trong ựất không khử trùng là 32 Ờ 38 ngày. Mật ựộ vi khuẩn Erwinia
carotovora giảm dần theo thời gian tồn tại trong nước cất nhưng khả năng gây bệnh không thay ựổi.
- Vi khuẩn Erwinia carotovora phát triển thuận lợi nhất ở nhiệt ựộ 300C và ựộ pH = 8.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 81
- Nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora tối thiểu có thể gây bệnh thối nhũn trên hành là 2x104 cfu/ml. Nồng ựộ vi khuẩn Erwinia carotovora càng cao thì khả năng gây bệnh thối nhũn trên hành càng lớn.
- Cây hành trồng trên ựất cao có tỷ lệ bệnh thấp hơn hai chân ựất trung bình và thấp. Tỷ lệ bệnh tương ứng trên các chân ựất cao, trung bình và thấp là 4,11%, 7,44% và 9,61%. Công thức bón 125 kg ựạm/ha có tỷ lệ bệnh cao hơn các công thức bón 100 và 110 kg ựạm/ha nhưng năng suất cao hơn. Các công thức bón 140 và 150 kg ựạm/ha có chi phắ ựầu tư cao hơn, tỷ lệ bệnh thối nhũn cao hơn nhưng năng suất chỉ tương ựương với công thức bón 125 kg ựạm/ha.
- Tỷ lệ bệnh thối nhũn trên hành tắm thấp hơn hành trắng. Tỷ lệ bệnh tương ứng trên hành tắm và hành trắng lần lượt là 9,27% và 12,79%. Trong ựiều kiện lây nhiễm nhân tạo, giống hành tắm cũng bị bệnh thối nhũn với tỷ lệ thấp hơn giống hành trắng. Thời kỳ tiềm dục trên giống hành trắng trong ựiều kiện có vết thương và không có vết thương là 3 ngày và 8 ngày, trên giống hành tắm tương ứng là 4 ngày và 10 ngày.
- Các loại thuốc Kamsu 2L nồng ựộ 0,2%, Kasumin 2SL nồng ựộ 0,3% và
Newkasuran 16.6 BTN nồng ựộ 0,25% ựều có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia
carotovora trên môi trường PDA cũng như có hiệu lực phòng trừ cao trên ựồng ruộng. So với hai loại thuốc Kamsu 2L và Kasumin 2SL, Newkasuran 16.6 BTN có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia carotovora tốt hơn trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm và có hiệu lực phòng trừ cao hơn trên ựồng ruộng.
- Vi khuẩn Bacillus thuringiensis có tác dụng hạn chế nhất ựịnh khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia carotovora trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm.
5.2. đề nghị
- Hạn chế việc tạo ra các vết thương cơ giới trên cây hành trong quá trình chăm sóc trên ựồng ruộng và củ hành trước khi ựưa vào bảo quản.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 82
trồng hành trên chân ựất thấp.
- Bón ựạm ure với lượng 125 kg/ha theo ựúng quy trình kỹ thuật trồng hành ựã ựược khuyến cáo.
- Tăng tỷ lệ diện tắch trồng giống hành tắm, ựặc biệt là ở những ruộng bị bệnh thối nhũn hại nặng.
- Khi bệnh mới xuất hiện, nên dùng thuốc Newkasuran 16.6 BTN ựể phun với nồng ựộ 0,25%. Có thể thay thế bằng thuốc Kamsu 2L nồng ựộ 0,2% hoặc Kasumin 2SL nồng ựộ 0,3%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu trong nước
1. Bộ NN&PTNT, 2010. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp ựiều tra phát hiện dịch hại cây trồng: 6
2. đỗ Tấn Dũng (2001). "Bệnh héo rũ hại cây trồng cạn." NXB, Nông nghiệp, Hà Nội.
3. đỗ Tấn Dũng (2003). "Nghiên cứu phạm vi ký chủ của nấm Fusarium sp hại trên một số cây trồng, cây cảnh và cỏ dại vùng Hà Nội." đại học Nông nghiệp 1, Hà Nội.
4. Vũ Triệu Mân (2007). "Giáo trình bệnh cây chuyên khoa." NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Vũ Triệu Mân (2007). "Giáo trình bệnh cây ựại cương." NXB Nông Nghiệp, Hà Nội: 91-108, 134-155.
6. Nguyễn Thị Nghiêm (2006). "Tài liệu tập huấn khuyến nông (tài liệu lưu hành nội bộ)." Trường đại Học Cần Thơ.
7. Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999). "Bệnh virus và vi khuẩn hại cây trồng." NXB Giáo Dục, Hà Nội.
8. Lê Minh Thi và CTV (1982). "Nghiên cứu bệnh hại hành tại Mê Linh - Vĩnh Phú." Hội nghị khoa học Viện Bảo vệ thực vật.
9. Nguyễn Thanh Trà và cộng sự (2008). "Khảo sát khả năng phòng trừ bệnh thối nhũn địa lan do vi khuẩn Erwinia carotovora Holl gây ra của Plumbagin và một số dẫn xuất." Kết quả nghiên cứu khoa học. Tập san BVTV, Cục Bảo vệ thực vật Số 4.
10.Hà Minh Trung (1988). "Hướng dẫn nghiên cứu bệnh vi khuẩn thực vật." Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội: 223.
2. Tài liệu nước ngoài
11.A Darrasse, S. P., A Kotoujansky, and Y Bertheau (1994). "PCR and restriction fragment length polymorphism of a pel gene as a tool to identify Erwinia carotovora in relation to potato diseases." Appl Environ Microbiol
60(5): 1437-1443.
12.Aysan, Y. S., H. Sahin, F. Cetinkaya-Yildiz, R. (2005). "Present Status of Bacterial Stem Rot on Tomato in Turkey." ACTA HORTICULTURAE 695: pages 97-100
13.Brewer, Harrison, et al. (1980). "Differential attraction of Drosophila melanogaster Meig. to potato tissue infected with two varieties of Erwinia carotovora." American Potato Journal 57(5): 219-224.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 84
14.ẵerkauskas, R. F. and J. Brown (2001). "Bacterial stem and peduncle canker of greenhouse pepper." Agricultural and Agri-Food Canada 23: 300Ờ306. 15.ẵetinkaya-Yildiz and Y. Aysan "A NEW SEED-BORNE PATHOGEN ON
TOMATO: ERWINIA CAROTOVORA SUBSP. CAROTOVORA AND SOME SEED TREATMENTS." Acta Hort. (ISHS) 729: 449-452.
16.Dong, Y. H., X. F. Zhang, et al. (2004). "Insecticidal Bacillus thuringiensis silences Erwinia carotovora virulence by a new form of microbial antagonism, signal interference." Appl Environ Microbiol 70(2): 954-960. 17.Dongmei, H., B. Huifang, et al. (2008). "[Identification and characterization
of novel antimicrobial protein APn5 against Erwinia carotovora]." Wei Sheng Wu Xue Bao 48(9): 1192-1197.
18.Gallois, Samson, et al. (1992). "Erwinia carotovora subsp. odorifera subsp. nov., associated with odorous soft rot of chicory (Cichorium intybus L.)." International Journal of Systematic Bacteriology 42(4)(582-588).
19.Goto and Matsumoto (1987). "Erwinia carotovora subsp. wasabip subsp. nov. isolated from diseased rhizomes and fibrous roots of Japanese horseradish (Eutrema wasabi Maxim.)." International Journal of Systematic Bacteriology 37(2): 130-135.
20.Graham and Harrison (1975). "Potential spread of Erwinia spp. in aerosols." Phytopathology 65(6): 739-741.
21.Itagaki, Araki, et al. (1983). "Analysis of tobacco production under the abnormal weather of 1980 in the Northeastern District of Japan. IV. Relationship between weather conditions and losses in yield of tobacco caused by diseases and insect pests." Bulletin of the Morioka Tobacco Experiment Station No.17: 53-62.
22.Jamil, B., F. Hasan, et al. (2007). "Isolation of bacillus subtilis MH-4 from soil and its potential of polypeptidic antibiotic production." Pak J Pharm Sci
20(1): 26-31.
23.Jensen, R. A., S. L. Stenmark, et al. (1972). "Molecular basis for the differential anti-metabolite action of D-tyrosine in strains 23 and 168 of Bacillus subtilis." Arch Mikrobiol 87(2): 173-180.
24.Kloepper, Harrison, et al. (1979). "The association of Erwinia carotovora var. atroseptica and Erwinia carotovora var. carotovora with insects in Colorado." American Potato Journal 56(7): 351-361.
25.Lelliott and Stead (1987). "Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants." Oxford, UK Blackwell Scientific Publications, 216 pp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 85
26.Mathews, H., et al., Activation tagging in tomato identifies a transcriptional
regulator of anthocyanin biosynthesis, modification, and transport. Plant
Cell, 2003. 15(8): p. 1689-703.
27.Nasser, W., F. Chalet, et al. (1990). "Purification and characterization of extracellular pectate lyase from Bacillus subtilis." Biochimie 72(9): 689-695. 28.Perombelon and Hyman (1986). "A rapid method for identifying and
quantifying soft rot erwinias directly from plant material based on their temperature tolerance and sensitivity to erythromycin." Journal of Applied Bacteriology 60(1): 61-66.
29.Perombelon and Hyman (1987). "Frequency of Erwinia carotovora in the Alyth Burn in eastern Scotland and the sources of the bacterium." Journal of Applied Bacteriology 63(4): 281-291.
30.Perombelon and Hyman (1989). "Survival of soft rot coliforms, Erwinia carotovora subsp. carotovora and E. carotovora subsp. atroseptica in soil in Scotland." Journal of Applied Bacteriology 66(2): 95-106.
31.Phokum C., J. P., Photchanachai S. and Cheevadhanarak S. "Detection and classification of soft rot Erwinia of vegetables in Thailand by DNA polymerase chain reaction." Acta-Horticulturae 712(2): 917-925.
32.Reeves, Olanya, et al. (1999). "Evaluation of potato varieties and selections for resistance to bacterial soft rot." American Journal of Potato Research
76(4): 183-189.
33.Schaad (1988). "A Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria." American Phytopathological Society Press.
34.Seo, S. T., N. Furuya, et al. (2001). "Phenotypic and Genetic Diversity of Erwinia carotovora ssp. carotovora Strains from Asia." J.Phytopathology
150: 120-127.
35.Shahbaz, M. U. Ghazanfar, et al. (2007). "Physiology of erwinias associated with back leg of potato." Pakistan Journal Agriculture Science 44(2): 259- 265.
36.Sharga, B. M. and G. D. Lyon (1998). "Bacillus subtilis BS 107 as an antagonist of potato blackleg and soft rot bacteria." Can J Microbiol 44(8): 777-783.
37.So Young Yoo, S. Y. P., Won Min Yoo, Kyung Hee Chang, Nae Choon Yoo, June Myung Kim, Seung Min Yoo, Ki Chang Keum and Sang Yup Lee (2002). "Design of ITS and 23S rDNA Ờ Targeted Probes and Its Usefulness for the Identification of Bacterial Pathogen." Genome Informatics 13: 589-590.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 86
38.Stanghellini (1982). "Soft rotting bacteria in the rhizosphere In: Mount MS, Lacey GH, ed." Phytopathogenic Procaryotes. New York, USA Academic Press: 249-263
39.Subandiyah S., I. T., Tsuyumu S. and Ieki H. (2000). "Comparison of 16S rDNA and 16S/23S Intergenic Region Sequences Among Citrus Greening Organisms in Asia." Plant Disease 84: 15-18.
40.Thomson, Hildebrand, et al. (1981). " Identification and nutritional differentiation of the Erwinia sugar beet pathogen from members of Erwinia carotovora and Erwinia chrysanthemi." Phytopathology 71(10): 1037-1042. 41.Toth, A. A, et al. (2002). "Application of amplified fragment length
polymorphism fingerprinting for taxonomy and identification of the soft rot bacteria Erwinia carotovora and Erwinia chrysanthemi." Applied and Environmental Microbiology 68(4): 1499-1508.
42.Turner, M. S. and J. D. Helmann (2000). "Mutations in multidrug efflux homologs, sugar isomerases, and antimicrobial biosynthesis genes differentially elevate activity of the sigma(X) and sigma(W) factors in Bacillus subtilis." J Bacteriol 182(18): 5202-5210.
43.Wright, P. J. (1998). "Plant disease record A soft rot of calla (Zantedeschia spp. ) caused by Erwinia carotovora subspecies carotovora." New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 26(4): 331-334.
3. Một số website tham khảo
1. http://wikipedia.com/index.php/Erwinia_carotovora Truy cập 20h34 phút ngày 15/07/2011
2. http://www.google.com.vn/search/Welsh_onion_disease truy cập 20h38 phút ngày 15/07/2011
3. http://www.docjax.com/Search/index.shtml?q=bacterial+soft+rot+on+onion &x=0&y=0 truy cập 19h30 phút ngày 18/07/2011
4. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_subtilis truy cập 23h15 ngày 08/02/2012
5. http://www.docjax.com/Search/index.shtml?q=pseudomonas+fluorescen+co ntrol+erwinia+carotovora&x=0&y=0 truy cập 21h20 ngày 17/02/2012
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 87
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Một số hình ảnh trong quá trình thực hiện ựề tài