Taxifolin (C15H22O7, 81) thu được từ sự thủy phân của astilbin là nguồn nguyên liệu cho việc nghiên cứu bán tổng hợp alphitonin. Từ astilbin tương đối sạch đạt trên 95% đã được thủy phân bằng HCl/MeOH theo phương pháp thơng thường. Sản phẩm thủy phân đã được phân lập kết hợp SKC và kết tinh thu được taxifolin sạch. Cấu trúc của sản phẩm đã được xác định bằng các phương pháp phổ phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ của taxifolin đã được cơng bố.
Phổ khối ion hĩa phun mù điện tử cho pic ion âm giả phân tử [M-H]ˉ với m/z= 303 phù hợp với trọng lượng phân tử taxifolin. Trên phổ proton 1H-NMR của sản phẩm thủy phân, taxifolin, khơng cịn các tín hiệu của đường Rhamnose, chỉ cịn
các tín hiệu của các proton của 3 vịng A, B, C. Ở vùng trường thơm là tín hiệu của 5 proton methine thơm của 2 vịng A và B, vịng B cho các tín hiệu của các proton thơm hệ ABX ở δC 6,98 ppm (d, H-2′) với Jmeta = 2,0 Hz, ở δC 6,87 (dd, H-6′) với
Jmeta = 2,0 Hz và Jortho = 8,0 Hz, ở δC 6,82 (d, H-5′) với J = 8,0 Hz; vịng A cho các tín hiệu doublet của 2 proton thơm meta ở δC5,94(d, H-5); 5,90 (d, H-7) với Jmeta = 2,0 Hz. Ở trường cao hơn là 2 cặp doublet của vịng C ở δC 4,92 (d, H-2) và δC 4,52 (d, H-3) với J = 11,5 Hz là tương tác của các Haxial vicinal ở vị trí trans.
Phổ 13C-NMR của hợp chất 81 (Hình 4.11) cho tín hiệu của 15 carbon của khung flavonol ít thay đổi so với trong phân tử glucoside (astilbin). Hai vịng A và B cho các tín hiệu của 12 carbon ở vùng trường thơm gồm 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy của ở δC 168,71 (C-7), 165,32 (C-5), 164,52 (C-9); 147,15 (C- 4′), 146,32 (C-3′) và 5 carbon methine thơm ở δC 120,90 (C-6′); 116,10(C-5′), 115,89 (C-2′), 97,31 (C-6); 96,28 (C-8) và 2 carbon thơm bậc 4 ở δC 129,88 (C-1′), 101,85 (C-10). Vịng C cho 3 tín hiệu ở δC 198,41 (CO); 85,13 (C-2); 73,68 (C-3). Các tín hiệu này khẳng định khung chắc chắn của flavonol taxifolin.
Hình 4.11. Phổ 13C-NMR của chất 81 (CD3OD)
4.1.2.4. Phản ứng đồng phân hĩa taxifolin tổng hợp alphitonin
Hình 4.12. Sơ đồ phản ứng đồng phân hĩa taxifolin tổng hợp alphitonin Trong tài liệu đã cơng bố [138], alphitonin và maesospin được tổng hợp từ taxifolin và dihydrokaempferol tương ứng. Theo tài liệu này, con đường tổng hợp đi qua các bước bảo vệ các nhĩm OH-phenolic với benzyl bromide tạo thành các hợp chất phenyl-O-benzyl. Bước tiếp theo là phản ứng đồng phân hĩa hợp chất đã được bảo vệ trong DMF ở nhiệt độ cao. Sau đĩ, đề các nhĩm bảo vệ thu được alphitonin và maesopsin tương ứng (Hình 1.47). Chúng tơi cũng đã nghiên cứu tổng hợp lặp lại, kết quả cho thấy rất khĩ triển khai phản ứng với lượng gam theo phương pháp này. Vì vậy, phương pháp đồng phân hĩa taxifolin thành alphitonin theo của
Kielhmann [134] đã được lựa chọn nghiên cứu. Theo phương pháp này dưới tác dụng của nhiệt trong điều kiện trơ, taxifolin bị đồng phân hĩa thành alphitonin. Phản ứng đồng phân hĩa taxifolin được giả thiết xảy ra theo cơ chế trình bày trong Hình 4.13.
Hình 4.13. Sơ đồ cơ chế phản ứng đồng phân hĩa taxifolin
Theo Kielhmann [134], Paul [132], ở nhiệt độ cao hay cĩ mặt của xúc tác acid/base, liên kết 1-2 (C-O) trong vịng dị tố C mở ra tạo thành quinone methine
81a. Hợp chất quinone methine 81a hoặc cĩ thể đĩng vịng lại cho hỗn hợp sản phẩm 81d gồm 4 đồng phân (±)-taxifolin và (±)-epimertaxifolin; hoặc tautomer hĩa hình thành chalcone 81b rồi diketone 81c và đĩng vịng với sự cấu trúc lại thành vịng 5 bền hơn cho sản phẩm (±)-alphitonin (82). Paul đã chứng minh sự cĩ mặt của 4 đồng phân (±)-taxifolin và (±)-epimertaxifolin trong giai đoạn đầu của hỗn hợp phản ứng dựa trên phổ CD và đã phân lập được cả 4 đồng phân này. Quá trình cấu trúc lại thành vịng 5 hình thành (±)-alphitonin đã được cả Kielhmann và Paul
đề nghị qua hợp chất trung gian diketone 81c. Để giải thích cho sự hình thành sản phẩm racemate Paul đã đưa ra trạng thái chuyển tiếp của diketone 81c kết hợp với 2 phân tử nước với các mức năng lượng nhỏ cĩ thể dễ dàng vượt qua ở nhiệt độ phịng. Do sự racemate nhanh của alphitonin nên khơng thu được sản phẩm chọn lọc lập thể của phản ứng.
Nghiên cứu các điều kiện nhiệt độ, dung mơi và thời gian ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng đồng phân hĩa taxifolin
Kết quả ở Bảng 4.4, Bảng 4.5, Bảng 4.6 cho thấy các điều kiện về nhiệt độ, dung mơi và thời gian ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng đồng phân hĩa taxifolin.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ
STT* 1 2 3 4
Nhiệt độ (°C) 145 150 155 160
Hiệu suất (%) 42,4 57,9 65 54,5
* Phản ứng được tiến hành với tỉ lệ taxifolin/H2O (1 mmol/7 mL) trong 95 giờ.
Bảng 4.4 cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất phản ứng, ở nhiệt độ thấp do sự hình thành của sản phẩm phụ dihydroquercetin làm giảm hiệu suất phản ứng. Ở nhiệt độ quá cao dẫn đến phân hủy sản phẩm làm giảm hiệu suất phản ứng, hiệu suất phản ứng cao nhất ở nhiệt độ dầu cấp là 155°C.
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của dung mơi
STT* 1 2 3 4 5
H2O (V, mL) 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
Hiệu suất (%) 43,0 44,0 65 33,8 26,0
* Phản ứng được tiến hành với 1 mmol taxifolin ở 155°C trong 95 giờ.
Bảng 4.5 cho thấy tỉ lệ chất phản ứng và dung mơi thích hợp nhất là 1 mmol taxifolin/7 mL H2O, hiệu suất phản ứng thấp hơn khi tỉ lệ này thay đổi
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian
STT* 1 2 3 4 5
Thời gian (h) 80 85 90 95 100
Hiệu suất (%) 56,0 58,8 64,0 65,0 54,9
Bảng 4.6 cho thấy tốc độ quá trình đồng phân hĩa diễn ra khá chậm, kéo dài đến 95 giờ. Thời gian ít hơn hay nhiều hơn đều làm giảm hiệu suất phản ứng.
Sau khi đã khảo sát và chọn lựa các điều kiện phản ứng, chúng tơi đã khảo sát độ ổn định của phản ứng. Các kết quả thu được được trình bày trong Bảng 4.7.
Bảng 4.7. Khảo sát độ ổn định của phản ứng SSố TT Taxifolin (g/ mmol) V H2O (mL) Thời gian (h) Nhiệt độ dầu (°C) Hiệu suất (%) 1 0,304/ 1 7 95 155 65,0 2 1,52/ 5 35 95 155 65,1 3 3,03/ 10 70 95 155 64,7 4 4,56/ 15 105 95 155 64,8
Bảng 4.7 cho thấy ở các điều kiện đã chọn lọc phản ứng đồng phân hĩa cho hiệu suất khá ổn định với lượng mol của taxifolin từ 1mmol, 5mmol, 10 mmol và 15 mmol.
Như vậy, các kết quả khảo sát đã chỉ ra phản ứng đồng phân hĩa taxifolin cho hiệu suất cao ổn định ở điều kiện dung mơi là 1 mmol taxifolin/7 mL H2O với thời gian phản ứng là 95 giờ ở nhiệt độ dầu cấp nhiệt là 155°C, hiệu suất alphitonin đạt tới 65%. Kết quả này rất hữu ích cho việc nghiên cứu bán tổng hợp alphitonin từ taxifolin ở lượng cân lớn đáp ứng các nhu cầu nghiên cứu chuyển hĩa và thử hoạt tính tiếp theo của alphitonin.
Tương tự như maesopsin (98), phổ NMR của hợp chất 82 cho các tín hiệu của các proton và carbon khung auronol, các số liệu phổ phù hợp với cấu trúc phân tử và với các số liệu đã được cơng bố [132, 134]. Phổ khối ion hĩa phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử đề proton hĩa [M-H]ˉ với m/z = 303 phù hợp với cơng thức phân tử C15H12O7.
Hình 4.14. Phổ ESI-MS của chất 82
Hình 4.15. Phổ 1H-NMR của chất 82 (acetone- d6)
Ở vùng trường thấp phổ proton 1H-NMR (Hình 4.15) cho các tín hiệu singlet tù của các proton OH ở δH 9,65, 7,70, 7,76. Ở vùng trường thơm cho 5 tín hiệu của 5 proton thơm của 2 vịng A và B. Vịng B cho 3 tín hiệu của 3 proton dạng ABX ở
δH 6,72 (d, J = 2 Hz, H-2′); ở δH 6,61 (d, J = 8,0 Hz, H-5′) và ở δH 6,54 (dd, J = 2,0 và 8,0 Hz, H-6′). Vịng A cho 2 cặp doublet của các proton meta ở δH 5,86 (d, H-5) và ở δH 5,82 (d, H-7) với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz. Hai proton metylene CH2-10cho 2 doublet ở δH 3,05 và ở δH 3,02 với hằng số tương tác Jgem = 13,5 Hz.
Hình 4.16. Phổ 13C-NMR của chất 82 (acetone- d6)
Phổ carbon 13C-NMR (Hình 4.16) cho tín hiệu của 15 carbon khung auronol bao gồm 12 carbon thơm 2 vịng A và B, 2 carbon thuộc vịng C và một carbon methylene. Hai vịng thơm A, B cho 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở C 172,5(C-8), 169,6 (C-6), 158,8 (C-4), 145,3 (C-3′) và 144,7 (C-4′); 6 tín hiệu của 6 carbon methine thơm ở C 122,9 (C-2′), 118,5 (C-6′), 115,5 (C-5′), ở C 96,7 và 91,4 (C-5 và C- 7), 2 tín hiệu của 2 carbon thơm bậc 4 ở C126,3 (C-1′) và 102,7 (C-9). Vịng C cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 195,4 (3-C=O) và tín hiệu của carbon hemicetal ở C107,0 (C-2). Ở trường cao là tín hiệu của carbon methylene C-10 ở C 41,8. Như vậy các tín hiệu phổ NMR khung auronol của aglycone alphitonin (chất 82) ít thay đổi so với trong phân tử glucoside của nĩ (chất 125). Phổ HSQC (phụ lục 7) cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC (Hình 4.17) cho các tương tác xa của 2 proton CH2-10 (3,05, 3,02 ppm)/C-2 (107,0 ppm)/C-1′(126,3
ppm)/C-6′ (122,9 ppm)/C-2′ (118,5 ppm)/C-3 (195,4 ppm), cùng với độ chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (172,5 ppm) và C-6 (169,6 ppm) do ảnh hưởng sức căng vịng 5 (vịng C), đã chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 82.
Hình 4.17. Phổ HMBC của chất 82 (acetone- d6)