Astilbin đã được nghiên cứu phân lập từ rễ Thổ phục linh theo một số phương pháp như:
- Phương pháp 1 sử dụng tính chất acid của hợp chất phenolic, từ cặn dịch chiết ethanol của rễ TPL sử dụng base để chuyển các hợp chất phenolic và acid về dạng muối rồi chiết loại hết các chất khơng tạo muối bằng butanol, sau đĩ acid hĩa lại và chiết các hợp chất phenolic trong đĩ thành phần chính là astilbin.
- Phương pháp 2 dựa vào tính tan của astilbin trong các dung mơi sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn kết hợp với SKC nhanh và kết tinh thu được astilbin sạch với hàm lượng > 95%.
Sau khi khảo sát các phương pháp phân lập chúng tơi đã lựa chọn quy trình sử dụng ethyl acetate làm dung mơi chiết, kết hợp các phương pháp SKC, kết tủa và kết tinh để phân lập astilbin với quy mơ 10 kg TPL/mẻ. Nguồn nguyên liệu được chúng tơi thu mua tại Tuyên Quang là mẫu cĩ hàm lượng astilbin cao và là vùng cịn cĩ thể thu mua với lượng lớn Thổ phục linh.
Mẫu Thổ phục linh khơ (10 kg) sau khi ngâm chiết theo quy trình thu được dịch cơ ethanol, pha lỗng với H2O và chiết lần lượt với n-hexan (1 × 2 L + 3 × 1 L) rồi với
Dịch chiết n-hexan và ethyl acetate được làm khan qua Na2SO4 rồi được quay cơ loại dung mơi thu được cao n-hexan (41 g) và cao ethyl acetate (EA, 465 g). Cao
EA được phân lập sơ bộ qua sắc ký cột nhanh trên silica gel thu được astilbin thơ (254 g) sau đĩ astilbin thơ được kết tinh lại từ hỗn hợp dung mơi MeOH/H2O (1/1; v/v) 3 lần thu được 100 g astilbin với hàm lượng 95,5% theo HPLC với hiệu suất tách 1,0 % so với trọng lượng mẫu khơ.
Các dữ liệu phổ của sản phẩm astilbin phân lập phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ của hợp chất này trong các tài liệu đã được cơng bố. Trên phổ proton 1H-NMR (phụ lục 12) của sản phẩm astilbin tại vùng trường thấp xuất hiện cụm tín hiệu của 3 proton methine thơm hệ ABX vịng thơm B ở δH 6,98 (d, H-2′) với Jmeta= 2,0 Hz, ở δH 6,86 (dd, H-6′) với 2 hằng số tương tác Jortho = 8,0 Hz, Jmeta= 2,0 Hz và ở δH 6,82 (d, H-5′) với Jortho = 8,0 Hz, cho thấy vịng B đã bị thế vào 2 vị trí C-3′ và C-4′. Ở trường cao hơn, 2 cặp doublet ở δH 5,94 (1H, d, H-6) và ở δH
5,92 (1H, d, H-8) với Jmeta= 2,0 Hz chứng tỏ vịng thơm A đã bị thế ở vị trí C-5, C- 7. Tín hiệu của các proton H-2, H-3 là các doublet ở δH 5,10 (d, H-2) và δH 4,60 (d, H-3) với hằng số tương tác lớn J = 10,5 Hz chứng tỏ là 2 proton- trans nằm ở 2
phía mặt phẳng phân tử. Các tín hiệu của đường Rhamnose gắn vào phân tử thể hiện rõ trên các tín hiệu double quartet (dq) của proton H-5′′ ở δH 4,28 (dq, J = 6,0 Hz và 9,6 Hz) do tương tác với các proton của nhĩm methyl 6-CH3 và proton H-4′′. Đặc biệt tín hiệu của proton anome H-1′′ ở δH 4,07 (d, J = 1,5 Hz), hằng số tương tác nhỏ chứng tỏ H-1′′ và H-2′′ là các liên kết equatorial cịn OH-1′′ và OH-2′′ là các liên kết axial và astilbin phân lập là taxifolin-α-L-rhamnoside. Các tín hiệu double doublet (dd) ở δH 3,68 (dd, J = 3,0 và 9,6 Hz, H-3′′) và δH 3,56 (dd, J = 1,5 và 3,0 Hz, H-2′′). Tín hiệu proton của H-4′′ bị che phủ bởi tín hiệu của proton methanol
OCH3 ở 3,36 ppm. Cuối cùng là tín hiệu doublet nhĩm -CH3 của H-6′′ ở δH 1,21 (J = 6,0 Hz).
Phổ 13C-NMR của chất 94 (phụ lục 12) cho 21 tín hiệu của 21 carbon của một flavonol glucoside bao gồm các tín hiệu của khung aglycone flavonol (taxifolin, 15 carbon) và phần đường rhamnoside (6 carbon). Các tín hiệu của các carbon khung flavonol bao gồm các carbon thơm của 2 vịng A và B nằm trong vùng trường thơm gồm 5 tín hiệu của carbon thơm liên kết với oxy ở δC 168,5 (C-7), 165,5 (C-5), 164,1 (C-9), 147,4 (C-4′) và 146,5 (C-3′) và 5 carbon methine thơm ở δC 120,5 (C- 6′); 116,3 (C-5′), 115,5 (C-2′); 97,4 (C-6); 96,2 (C-8) và 2 carbon thơm bậc 4 ở δC
129,2 (C-1′), 102,5 (C-10). Vịng C cho 3 tín hiệu: 1 carbon carbonyl ở δC 196,0 (C- 4); 2 carbon methine ở δC 83,9 (C-2) và δC 78,5 (C-3). Phần đường cho 6 tín hiệu của 6 carbon bao gồm 1 tín hiệu của carbon anome hemiacetal ở δC 102,1 (C-1′′); 4 carbon methine liên kết với oxy ở δC 70,5 (C-5′′); 73,8 (C-4′′); 72,2 (C-3′′); 71,8 (C- 2′′) và 1 carbon methyl ở δC 17,8 (C-6′′).