3.2.1. Hoạt tính kích thích lympho bào
5mL máu được lấy từ tĩnh mạch thỏ khỏe mạnh, chống đơng bằng heparin và phủ lên thể tích ficoll paque tương đương. Sau đĩ ly tâm ở tốc độ 3000 vịng / phút trong 30 phút. Tách, thu lấy lớp giữa, loại bỏ hồng cầu cịn lại bằng NH4Cl. Sau khi ly tâm, cặn tế bào được hịa lại trong HBSS. Số tế bào được đếm bằng buồng đếm neubaurer. Tế bào lympho sau khi thu nhận được hịa lại trong mơi trường nuơi cấy RPMI cĩ bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) với nồng độ tế bào 2 × 106 tế bào/mL.
Xác định khả năng kích thích miễn dịch thơng qua tăng sinh tế bào lympho
Phép thử được thực hiện như sau:
Tế bào lympho (180 L ) được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2 × 106 tế bào/mL.
Các chất thử 82, 98, 116, 125 (phân lập và tổng hợp), 126, 127, 128, 129, 130
(20 L) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để cĩ nồng độ là 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL. Concavalin A được sử dụng làm đối chứng với nồng độ là 5 g/mL, 2,5 g/mL, 1,25 g/mL và 0,625 g/mL. Mẫu được ủ trong 48h ở 37°C, 5% CO2.
3 giếng khác khơng cĩ chất thử nhưng cĩ tế bào (180 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng âm.
Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50 L MTT 1 mg/mL. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37°C trong 4h, loại bỏ mơi trường và thêm vào mỗi giếng 100 L DMSO. Đĩa tế bào được đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sĩng 490nm. Chỉ số kích thích (SI – stimulate index) được tính theo cơng thức:
Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.
DMSO 10% luơn được sử dụng như đối chứng âm. Chất thử nào cĩ SI > 1,2 sẽ được xem là cĩ khả năng kích thích miễn dịch. Nồng độ kích thích 50% sự phát
triển của tế bào (SD50 – Stimulate Dose at SI= 1,5) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4
3.2.2. Hoạt tính độc tế bào
Nuơi cấy tế bào in vitro
Các dịng tế bào được nuơi cấy dưới dạng đơn lớp trong mơi trường nuơi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, 1% PSF (Penicilline-Streptomycine-Fungizone), ngồi ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
Tế bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1/3) và nuơi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37°C, 5% CO2.
Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
Chất thử 82, 98, 116, 125 (phân lập và tổng hợp), 126, 127, 128, 129, 130 (20 L) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để cĩ nồng độ 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0.8 g/mL.
Trypsin hĩa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 L mơi trường) và để chúng phát triển trong vịng từ 3-5 ngày.
Một khay 96 giếng khác khơng cĩ chất thử nhưng cĩ TBUT (180 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.
Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37°C. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hịa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của
chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sĩng 515 nm. Khả năng sống sĩt của tế bào khi cĩ mặt chất thử sẽ được xác định thơng qua cơng thức sau:
% ức chế = 100% - % sống sĩt
Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luơn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL.
DMSO 10% luơn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2DV4. Chất thử nào cĩ IC50 < 20 g/mL (với chất chiết thơ, hoặc với phân đoạn hĩa học) hoặc IC50 4 g/mL (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là cĩ hoạt tính gây độc tế bào và cĩ khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside
4.1.1. Hai hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) (116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)
Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside
116
Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside
125
Hai hợp chất maesopsin 4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β- D-glucopyranoside (125) đã được phân lập từ lá cây Chay Bắc bộ bằng các phương pháp thường quy sử dụng SKC trên diaion, silica gel pha thường, pha đảo và sephadex. Theo phương pháp đã được cơng bố quy trình phân lập hai auronol glucoside (chất 116 và 125) sử dụng dung mơi chiết là butanol [6]. Khi tiến hành phân lập 2 hợp chất 116 và 125, từ lượng lớn mẫu lá Chay (10 kg), quy trình phân lập đã được thay đổi để khơng phải sử dụng butanol là một hĩa chất độc hại (cĩ mùi rất sốc và khi tiếp xúc nhiều gây đau đầu). Cao chiết ethanol thu được từ dịch chiết ethanol của lá Chay được pha lỗng với nước rồi được chiết với n-hexan để loại các chất kém phân cực. Dịch nước cịn lại được phân lập qua sắc ký cột trên diaion HP- 20 với hệ dung mơi MeOH/H2O ở các tỉ lệ 0/100 50/50 và 100/0 (v/v) thu được 3 phân đoạn PA1, PA2, PA3. Trong đĩ, phân đoạn PA1 là các hợp chất tan trong nước bao gồm đường và các muối vơ cơ, phân đoạn PA2 là hỗn hợp gồm các chất chính là chất 116 và chất 125 ngồi ra cịn các chất khác là đường và một số chất kém phân cực hơn chất 116, phân đoạn PA3 là gồm các chất cĩ độ phân cực kém hơn chất 116. Phân đoạn PA2 được phân lập bằng SKC trên silica gel với hệ dung mơi rửa giải EA/MeOH/H2O (13/7/1, v/v/v) thu được 4 phân đoạn PB1, PB2, PB3, PB4. Phân đoạn PB2 giàu chất 116 được phân lập tiếp bằng SKC trên silica gel với
hệ dung mơi rửa giải EA/MeOH/H2O (13/7/1, v/v/v) thu được PC1 (10 g), PC1
được phân lập tiếp bằng SKC pha đảo với hệ dung mơi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4, 1/7, 1/9) thu được 7 g TAT2 sạch (hiệu suất tách > 0,07% so với trọng lượng mẫu khơ). Phân đoạn PB3 giàu chất 125, được phân lập bằng SKC trên sephadex 2 lần với dung mơi MeOH thu được PC2 (0,5 g), sau đĩ PC2 được phân lập tiếp bằng SKC pha đảo với hệ dung mơi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4, 1/7, 1/9), quá trình được lặp lại 3 lần thu được TAT6 sạch (0,03 g, hiệu suất tách 0,0003% so với trọng lượng mẫu khơ).
Các số liệu phổ của chất 116 và 125 cho các tín hiệu phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ đã được cơng bố Bảng 4.1 và Bảng 4.2.
Phổ khối ESI-MS của chất 116 và 125 cho các pic ion âm giả phân tử m/z =
449 [M-H]ˉ và 465 [M-H]ˉ phù hợp với cơng thức phân tử của mỗi chất C21H22O11 và C21H22O12 tương ứng. Các số liệu phổ NMR của chất 116 thể hiện chất này là một auronol glucoside, phân tử gồm cĩ phần aglycone maesopsin gắn với phần đường glucopyranoside. Trên phổ NMR của chất 116 ta thấy cĩ rất nhiều cặp tín hiệu rất gần nhau về độ chuyển dịch hĩa học (tín hiệu kép), điều này cĩ thể cĩ 2 giả thiết: 1, hoặc do trong phân tử cĩ phần aglycone cĩ trung tâm bất đối C*-2 kết hợp với 4 trung tâm bất đối của phần đường tạo nên các diasteromer tách được trong từ trường đo; 2, hoặc do phân tử đường cồng kềnh bị cản trở bởi nhĩm ketone (3- C=O) khơng quay tự do được mà chỉ cĩ khả năng quay về 2 phía của mặt phẳng benzofuranone (A và C) cũng tạo nên các tín hiệu kép trong phổ NMR. Phổ 1H- NMR của chất 116 (Hình 4.1) cho các tín hiệu tù rộng của các proton OH ở vùng trường thấp với δH 9,1 và δH 7,6/7,5. Ở vùng trường thơm là các cặp tín hiệu doublet của các proton methine thơm vịng B hệ AA′XX′ ở H 6,93 (2H, H-2′, H-6′) và 6,56 (2H, H-3′, H-5′) với hằng số tương tác Jortho = 8,5 Hz, như vậy, nhĩm OH thế ở vị trí C-4′. Cũng ở vùng trường thơm nhưng ở trường cao hơn là các cặp tín hiệu doublet của các proton thơm meta vịng A ở δH 6,00/6,04 và δH 5,93/5,92 (H-5, H-7) với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz, Ở vùng trường cao hơn là các tín hiệu proton OH ở δH 5,20/5,13, 5,06/ 5,01, tiếp theo là cặp tín hiệu doublet của proton methine anomeric H-1′′ của phân tử đường ở H 4,97/4,90 với hằng số tương tác J = 7,5 Hz
cho thấy đây là đường -D-glucopyranoside, ở trường cao hơn là cặp tín hiệu
proton OH ở H 4,59/4,50 và H 3,38. Phần đường cịn cho các tín hiệu của các proton methylene ở H 3,64/3,63 (br m, Ha-6′′) và ở H 3,48 (m, Hb-6′′), các tín hiệu multiplet ở vùng từ 3,29 - 3,20 ppm là tín hiệu của 4 proton methine H-3′′, H-5′′, H- 2′′ và H-4′′.
Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của chất 116 (DMSO- d6)
Phổ 13C-NMR (Hình 4.2) của chất 116 cũng cho các tín hiệu kép của 21 carbon bao gồm 15 tín hiệu carbon của phần aglycone thuộc khung auronol và 6 tín hiệu carbon thuộc phần đường glucopyranoside. Ở vùng trường thấp là tín hiệu của carbon carbonyl (3-C=O) ở C 192,8/192,4, tiếp theo là các tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy ở C 171,9 (C-8), C 168,5 (C-6), C156,8/156,7 (C-4), và C
155,9 (C-4′); sáu carbon methine thơm bao gồm 4 carbon của vịng B ở C 131,3 (C-2′, C-6′) và C 114,7, 114,6 (C-3′, C-5′) và 2 carbon methine thơm của vịng A ở
C 95,8/95,3 và C 91,7/91,6 (C-5 và C-7). Ở vịng A, B cịn cĩ hai carbon thơm bậc 4 của C-1′ ở C 124,2/124,17 và của C-9 ở C 102,0/101,8 và cụm tín hiệu của các carbon thuộc phần đường gồm cĩ tín hiệu của carbon hemiacetal C-1′′ ở C
99,4/99,3, tiếp theo là các cặp tín hiệu của 4 carbon methine liên kết với oxy ở C
77,19/77,15 (C-5′′); 76,84/76,74 (C-3′′); 72,95/72,91 (C-2′′); 69,32/69,23 (C-4′′) và cặp tín hiệu của carbon methylene liên kết với oxy ở C 60,45/60,32/59,8 (C-6′′). Cuối cùng là tín hiệu của carbon methylene ở C 40,5/40,1 (CH2-10). Kết hợp với phổ HSQC (phụ lục 14), phổ HMBC (phụ lục 14) cho các tương tác xa của proton methylene nhĩm CH2-10 (2,9 ppm) với C-1′ (124,20/124,17 ppm)/C-2′, C-6′ (131,3 ppm)/3-CO (192,7/192/4). Proton H-1′′ (4,90/4,97 ppm) cho tương tác xa với C-4 (156,8/156,7 ppm) chứng tỏ phần đường gắn vào C-4 của aglycone (maesopsine) cùng với độ chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (173,9 ppm) do sức căng của vịng C chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 116.
Các số liệu phổ của chất 125 cũng khẳng định hợp chất này là một auronol glucoside, phân tử gồm cĩ phần aglycone alphitonin gắn với phần đường glucopyranoside. Pic ion âm giả phân tử của chất 125 lớn hơn chất 116 một nhĩm OH, điều này cũng thể hiện trên phổ NMR của chúng. Cũng giống chất 116, các tín hiệu trên phổ NMR (Hình 4.3; Hình 4.4) của chất 125 cũng xuất hiện các cặp tín hiệu kép. Ở vùng trường thơm, phổ 1H-NMR cho tín hiệu kép của 5 proton methine thơm gồm 3 proton thơm hệ ABX vịng B ở H 6,66/6,67 (d, J = 2,5 Hz, H-2′), H
6,57/6,55 (d, J = 8,5 Hz, H-5′) và H 6,52/6,51 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-6′); và 2 proton thơm meta vịng A ở H 6,00/5,98 (d, J = 1,2 H, H-5) và ở H 5,88/5,87 (d, J= 1,2 Hz, H-7); Ở trường cao cho tín hiệu của nhĩm methylene ở H 3,04 (m, CH2- 10).
Hình 4.3. Phổ 1H-NMR của chất 125 (CD3OD)
Phổ 13C-NMR cho 15 tín hiệu của 15 carbon khung auronol: gồm 12 carbon thơm 2 vịng A và B, trong đĩ 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở C
(C-3′) và ở C 145,1 (C-4′); 5 tín hiệu của 5 carbon methine thơm ở C
123,1/123,0/(C-6′), ở C 118,7/118,6 (C-2′), ở C 115,9/115,8 (C-5′); 2 carbon thơm bậc 4 ở C 126,5/126,4 (C-1′) và ở C 101,7/101,5 (C-9); Vịng C cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 196,0/195,8 (3-C=O) và carbon hemicetal ở C 107,6/107,5 (C-2). Các tín hiệu của phần đường cũng tương tự như phần đường của chất 116. Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu của proton hemiacetal ở H 4,88 ppm bị che phủ bởi tín hiệu rộng của nước. Ở trường cao là các tín hiệu 2 proton của nhĩm methylene liên kết với oxy ở 3,88 ( br d, J =12,5 Hz, Hb-6′′) và ở 3,70 (m, Hb-6′′); ở 3,53 (dd, J = 8,0 , 9,0 Hz, H-2′′); từ 3,48-3,43 ppm là các multiplet của H-3′′, H-4′′ và H-5′′. Phổ HSQC (phụ lục 22) cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC (phụ lục 22) cho các tương tác xa phù hợp với cấu trúc phân tử được trình bày trên Bảng 4.1 và Bảng 4.2.
Hình 4.4. Phổ 13C-NMR của chất 125 (CD3OD)
Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H-NMR của maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)
[500MHz, CD3OD, giá trị (ppm), J (Hz)]
H Chất 125 (TAT6) Chất 116 (TAT2)
(Tài liệu)# (Phân lập) (Tài liệu)# (Phân lập)*** 5 6,07 d (1,7) [6,09 d (1,7)]* 6,0/5,98 d (1.2) 6,00 br s (8 Hz) 6,00 d (1,7 Hz) 7 5,96 d (1,7) [5,98 d (1,7)] 5.88/5.87 d (1.2) 5,88 br s (≈5 Hz) 5,93 d (1,7 Hz) 10 3,05 s [3,04 d (13,9)/3,06d(14,1)] 3,04 m 3,10 s [3,09 d (14,1)/3,11 d (14)]* 2,96 và 2,90 2 × d (13,5 Hz) 2′ 6,65 d (2,0) [6,66 d (2,0)] 6,66/6,67 d (2,5) 7.01 d (8,4) 6,93/6,91 d (8,5) 3′ 6,59 d (8,3) [6,58 d (8,30)] 6,56/6,54 d (8,5) 5′ 6,57 d (8,1) [6,55 d (8,0)] 6,57/6,55 d (8,5) 6,59 d (8,3) [6,58 d (8,30)] 6,56/6,54 d (8,5) 6′ 6,51 dd (8,1;2,1) [6,5dd (8,1;2,0)] 6,52/6,51 dd (2,5; 8,5) 7,01 d (8,4) 6,93/6,91 d (8,5) 1" 4,89 d (7,6) [4,87 d (7,4)] 4,89, tín hiệu chồng chập 4,85 d (7,6) 4,97/4,90 d (7,5) 2" 3,53m 3,53 dd (8,0; 9,0) 3,54 m 3,29-3,20 m 3" 3,49 m 3,48 m 3,48 m 4" 3,42 m 3,43 m 3,42 m 5" 3,41 m 3,43 m 3,43 m 6" 3,88 d (12,0)/3,68 dd (12,1;5,5) [3,89 d (12,1)/3,70 dd (12,0;5,0)] 3,88 brd (12,5) /3,70 m 3,88 brd (12,3) /3,70 m 3,64/3,63 brm 3,48 m
* Tương tác HMBC (s: mạnh; m: vừa; w: yếu);
** Tín hiệu trong ngoặc [] hoặc sau dấu / là tín hiệu của đồng phân;
*** Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất 116 đo trong DMSO.
Bảng 4.2. Số liệu phổ 13C-NMR của maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)
[125MHz, CD3OD, giá trị (ppm), J (Hz)]
C Chất 125 Chất 116
Tài liệu# Phân lập Tài liệu# Phân lập*** 2 107,66 [107,57]** 107,6/107,5 107,56 [107,60]** 105,6/105,5 3 197,01 [196,88] 196,0/195,8 196,15 [196,03] 192,76/192,4 4 158,37 [158,29] 158,4/158,3 158,49 [158,37] 156,8/156,7 5 97,19 [97,75] 99,0/98,3 98,20 [98,57] 95,8/95,3 6 171,49 174,8/174,6 174,22 168,5 7 93,20 [93,37] 94,0/93,8 93,96 [93,77] 91,7/91,5 8 174,64 [174,59] 174.9/174.7 174,62 171,9 9 103,42 [103,65] 101,7/101,5 102,68 [102,51] 102,0/101,8 10 42,17 42,3/41,2 41,97 40,5 1′ 126,17 [126,23] 126,5/126,4 125,72 [125,74] 124,2 2′ 118,62 [118,73] 118,7/118,6 132,51 131,3 3′ 145,62 145,6/145,5 115,77 [115,73] 114,7/114,6 4′ 145,16 [145,16] 145,12 157,2 155,9 5′ 115,90 [115,85] 115,9/115,8 115,77 [115,73] 114,7/114,6 6′ 123,08 [122,99] 123,1/123,0 132,51 131,3 1" 101,56 [101,67] 102,4/102,3 101,63 99,5/99,3 2" 73,97 [74,08] 74,1/74,0 74,02 [104,09] 73,0/72,9 3" 77,32 77,3 77,37 [77,34] 76,8/76,7 4" 71,16 71,1 71,14 69,3/69,2 5" 78,37 [78,30] 78,3/78,2 78,35 [78,29] 77,2/77,1 6" 62,30 62,2 62,30 60,4/60,3
* Tương tác HMBC (s: mạnh; m: vừa; w: yếu);
** Tín hiệu trong ngoặc [] hoặc sau dấu / là tín hiệu của đồng phân;
*** Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất 116 đo trong DMSO.
# Tài liệu [6]
Hình 4.5 là sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp chất 116 và chất 125 ở tỉ lệ 116/125
cho thấy chất 125 được phân lập là chất sạch cĩ thời gian lưu tại 6,223 phút và chất
116 cĩ thời gian lưu là 8,094 phút ở điều kiện tiến hành sắc ký.
Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp 2 chất 116/125
Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC của chất 125
4.1.1.1. Điều chế auronol maesopsin (98)
Kết quả phân lập hai hợp chất auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D- glucopyranoside (125) và maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) từ lá cây Chay Bắc bộ (A. tonkinensis) cho thấy hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O- β-D-Glc (116) cĩ hàm lượng khá lớn trong lá cây Chay Bắc bộ (> 0,07 %). Vì vậy