1.5.1. Giới thiệu chung về glycoside
Monosaccharide tồn tại cân bằng giữa dạng mở và dạng vịng. Trong dung dịch nước, các phân tử của chúng chủ yếu ở dạng vịng 5 cạnh (furanose) hoặc vịng 6 cạnh (pyranose), trong đĩ vịng pyranose chiếm tỷ lệ lớn hơn. Theo cấu trúc
Haworth, các pyranose tồn tại chủ yếu ở cấu dạng ghế C1 và 1C. Cấu dạng C1 thường sử dụng cho cấu hình D và 1C cho cấu hình L. Đối với D-glucopyranose, cấu dạng bền là C1, khi đĩ nhĩm hydroxyl của đồng phân anome α được đặt ở vị trí trục axial (a) và của β ở vị trí equatorial (e) (Hình 1.48) [139, 140].
Glycoside là hợp chất mà trong phân tử cĩ nhĩm glycone (đường) liên kết với nhĩm aglycone (khơng đường hoặc một phần genin) thơng qua liên kết glycosidic. Các glycoside cĩ thể liên kết bởi O-; S-; N- hoặc C-glycosidic, trong đĩ liên kết O- glycosidic là phong phú và quan trọng hơn cả [139] và cũng là phần chúng tơi nghiên cứu trong luận án với glycone là glucose (Hình 1.49).
Hình 1.48. α-D-glucopyranose (C1) và α-L-glucopyranose (1C)
Hình 1.49. Khung của glycoside
1.5.2. Một số phương pháp tổng hợp O-glucoside
Khi một monosaccharide được ngưng tụ với alcohol béo hoặc thơm hoặc một phần đường khác thơng qua nguyên tử oxy hình thành một liên kết O-glycosidic.
Các phương pháp phản ứng ghép nối phổ biến nhất được sử dụng để tổng hợp chúng [140, 141].
1.5.2.1. Phản ứng Michael
Hình 1.50. Sơ đồ phản ứng tổng hợp O-glycoside theo Michael
Phương pháp tổng hợp O-glucoside được Michael thực hiện đầu tiên từ phản
ứng giữa 2,3,4,6-Tetraacetyl-α-D-glucopyranosyl clorua (99) và kali phenoxide để tạo ra dẫn xuất acetyl (100), sau đĩ chúng được thủy phân trong base tạo phenyl-β- D-glucopyranoside (101) (Hình 1.50).
Phản ứng Fischer khơng sử dụng nhĩm bảo vệ và chỉ đơn giản bằng cách kết hợp giữa đường với alcohol khan trong điều kiện axit (Hình 1.51).
So với phương pháp Michael, phương pháp Fischer khơng cĩ tính chọn lọc lập thể, cho nên sản phẩm tạo ra là một hỗn hợp anome. Qua sơ đồ phản ứng cho thấy, nếu tăng nồng độ acid HCl và tăng nhiệt độ, phản ứng cĩ sự chuyển đổi từ dạng ít ổn định hơn methyl furanoside (102, 103) sang dạng ổn định hơn methyl α- và β-D- glucoside (104, 105), điều này cho thấy đây là sản phẩm nhiệt động lực học.
Hình 1.51. Sơ đồ phản ứng tổng hợp O-glycoside theo Fischer
1.5.2.3. Phản ứng Koenigs-Knorr
Phản ứng Koenigs-Knorr là một trong những phản ứng hữu ích và được sử dụng rộng rãi nhất trong tổng hợp các O-glycoside. Phản ứng từ một
glycopyranosyl halogenua (X = Cl, Br, I) đã được acetyl hĩa (106) với một alcohol hoặc nhĩm hydroxyl của đường khác trong sự cĩ mặt của xúc tác muối bạc: oxide, carbonate, nitrate, triflate hoặc cadmium carbonate (CdCO3)... [140, 141, 142], qua quá trình glycosyl hĩa hình thành một anome 107, thủy phân hợp chất này tạo sản phẩm 108
Hình 1.52. Sơ đồ phản ứng tổng hợp O-glycoside theo Koenigs - Knorr
Trong hầu hết các trường hợp, lập thể quan sát được như là một hệ quả, các sản phẩm thu được ở dạng 1,2-trans với nhĩm bên cạnh (C2) [140]. Như vậy, nếu
glycopyranosyl halogenua cĩ nhĩm acyloxy (C2) ở dạng cis với 1-halide, thường
trong quá trình phản ứng tạo cấu hình anome nghịch đảo (tức sản phẩm ở dạng 1,2-
trans glycoside), trong khi đĩ, nếu nhĩm acyloxy (C2) ở dạng trans với 1-halide,
phản ứng vẫn duy trì cấu hình anome thể hiện qua cơ chế ở Hình 1.53. Tuy nhiên, theo Jin-Hwan Kim và cộng sự [143] đã báo cáo tổng hợp 1,2-cis glycoside khi tại vị trí C2 là (1S)-phenyl-2-(phenylsulfanyl)ethyl, trong sự cĩ mặt của BF3/Et2O.
Hình 1.53. Cơ chế đề xuất tổng hợp 1,2-trans glycoside theo Koenigs - Knorr Trong cơ chế này, dưới tác dụng của xúc tác, halogen sẽ bị tách hình thành ion oxocarbenium (109). Tiếp đến, với sự tham gia của nhĩm bảo vệ acetyl tại C2 hình thành một ion acetoxonium (110) ổn định hơn. Ion này tạo điều kiện thuận lợi cho tác nhân nucleophine của alcohol tấn cơng vào anome trung tâm C1 từ một mặt tạo nên sản phẩm 1,2-trans glycoside (111).
Hình 1.54. Cơ chế tổng hợp 1,2-cis glycoside theo Jin - Hwan Kim
Sau khi hình thành ion oxocarbenium (113), các nucleophine phenylsulfanyl tại C-2 sẽ tham gia hình thành ion sulfonium trung gian dạng vịng trans-decalin
(114). Sự chuyển vị của ion sulfonium tại equatorial anomic bởi alcohol dẫn đến việc hình thành sản phẩm dạng 1,2-cis glycoside (115).
1.6.Hợp chất chứa nitrile trong hĩa dược và phương pháp tổng hợp dẫn xuất nitrile xuất nitrile
Hiện nay cĩ hơn 30 hợp chất chứa nitrile được sử dụng trong các thuốc chỉ định với thêm hơn 20 sản phẩm chứa nitrile được phát triển lâm sàng. Vai trị của
các tác nhân nitrile trong y học đã nổi lên và ngày một được chú trọng. Các cuộc điều tra cho thấy tác dụng hữu ích của các hợp chất chứa nitrile trong y học tập trung chủ yếu vào nhĩm −CN [10]. Nhĩm chức năng nitrile (–C≡N) là nhĩm phân tử nhỏ cĩ vai trị như một nhĩm hydroxyl hay nhĩm carboxyl, cĩ khả năng tạo liên kết hydro với các amino acid, các khung protein, enzyme hay với các phân tử nước trong phân tử [Hình 1.55]. Khi thay thế hoặc kết hợp nhĩm nitrile trong phân tử đã tăng hiệu quả tác dụng một cách đáng kể so với phân tử ban đầu [7, 8, 9, 10]. Chẳng hạn như, etoposide một loại thuốc chống ung thư, nếu thay thế các glycoside bởi nitrile sẽ làm tăng khả năng ức chế tế bào KB lên gấp đơi hoặc đối với cysteinyl proteases một enzym làm suy giảm protein, khi kết hợp với nitrile sẽ làm tăng khả năng liên kết với protein...
Hình 1.55. Khả năng tạo liên kết hydro của nitrile
Một số phương pháp tổng hợp dẫn xuất nitrile cơ bản
- Phản ứng Kolbe: là phản ứng SN2 giữa một alkyl halogenua (X= Br, Cl) béo với cyanua kim loại kiềm trong dung mơi DMSO hoặc acetone.
Hình 1.56. Phản ứng tổng hợp nitrile theo Kolbe
- Phản ứng Van Leusen: phản ứng chuyển đổi một ketone thành một nitrile
trong một bước duy nhất sử dụng tosylmethyl isocyanide (TosMIC).
Hình 1.57. Phản ứng tổng hợp nitrile theo Van Leusen
- Phản ứng theo Williamson ether: được sử dụng để tổng hợp O-acetonitrile,
phản ứng SN2 giữa alkoxides (hoặc phenoxide) với dẫn xuất halogenua hình thành sản phầm ether.
Hình 1.58. Phản ứng tổng hợp nitrile theo Williamson ether
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1.Đối tượng nghiên cứu
Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside 2,6-dihydroxy-2-[(3′,4′-dihydroxyphenyl) methyl]-3(2H)-benzofuranone-4-yl--D- glucopyranoside (TAT6) 2,6-dihydroxy-2-[(4′-hydroxyphenyl) methyl]-3(2H)-benzofuranone-4-yl-- D-glucopyranoside (TAT2) Alphitonin Maesopsin 2-(3,4-dihydroxybenzyl)-2,4,6-trihydroxy benzofuran-3(2H)-one (Ag-TAT6) 2-(4-hydroxybenzyl)-2,4,6-trihydroxy benzofuran-3(2H)-one (Ag-TAT2) 2.2.Mục tiêu
Nghiên cứu tổng hợp các auronol alphitonin, maesopsin, các auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT6) và maesopsin-4-O-β-D- glucopyranoside (TAT2) và một số các dẫn xuất nitrile của chúng. Thăm dị hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được.
2.3.Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện với bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sĩng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch ceri sulfat trong acid H2SO4, sấy khơ rồi hơ nĩng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đè tử ngoại ở hai bước sĩng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nĩng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau đĩ cạo lớp Silica gel cĩ chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung mơi thích hợp.
Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường cĩ cỡ hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo YMC RP-18 (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 ((Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
Sắc lý lỏng cao áp (HPLC)
Sắc ký lỏng cao áp Agilent technologies 1200 Series của Viện Hĩa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.3.2. Phương pháp tổng hợp và tinh chế sản phẩm
- Các phản ứng được thực hiện bằng các phương pháp tổng hợp hữu cơ cơ bản như phương pháp khử, phương pháp oxi hĩa, phương pháp ankyl hĩa, phương pháp glucosyl hĩa ... Ngồi ra cịn sử dụng một số phương pháp tổng hợp hữu cơ đặc thù như: phản ứng Houben - Hoesch, phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt...
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để giám sát tiến trình xảy ra của các phản ứng hĩa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.
- Các hợp chất sau phản ứng được phân lập và tinh chế bằng các phương pháp chiết, phương pháp sắc ký cột, phương pháp kết tinh,...
- Tất cả các hĩa chất dùng trong quá trình tổng hợp được mua từ các hãng: Sigma Aldrich, Merck và sử dụng mà khơng cần tinh chế lại.
- Các dung mơi sử dụng được cất lại hoặc làm khan theo điều kiện phản ứng.
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hĩa học
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hố học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thơng số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:
Phổ hồng ngoại (FT-IR) được đo bằng máy NICOLET IMPACT-410 FTIR của hãng Carl Zeiss Jena (Đức) tại Viện Hĩa học – Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Phổ khối lượng (ESI-MS) được ghi trên máy Agilent 6310 ion trap tại Viện Hĩa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều và 2 chiều sử dụng chất nội chuẩn là TMS (δ = 0ppm), dung mơi CDCl3 hoặc DMSO-d6 được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hố học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam ở tần số 500,13 MHz cho phổ 1H-NMR và ở tần số 125,76 MHz cho phổ 13C-NMR. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ và so sánh tài liệu.
2.3.4. Khảo sát hoạt tính ức chế miễn dịch và hoạt tính độc tế bào của các chất tổng hợp được tổng hợp được
Khảo sát hoạt tính kích thích tế bào lympo và hoạt tính độc tế bào trên dịng tế bào thường NIH/3T3 và 4 dịng tế bào ung thư: ung thư vú MCF7, ung thư phổi LU-1, ung thư biểu mơ KB và ung thư gan HepG2 được thực hiện tại phịng thử nghiệm sinh học- Viện Cơng nghệ sinh học - Viện hàn lâm khoa học và cơng nghệ Việt Nam.
2.3.4.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympo
Vật liệu nghiên cứu
- Thỏ dịng Newzeland White do Trung tâm dê thỏ Ba Vì cung cấp, cĩ khối lượng từ 2,0 đến 2,5 kg. Thỏ được nuơi ổn định một tuần trước khi thí nghiệm tại khu nuơi động vật của Viện Cơng nghệ sinh học.
- Mơi trường nuơi cấy tế bào là RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium) và các hĩa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco, Invitrogen v.v.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp phân lập tế bào lympho tổng số:
Được thực hiện theo thường quy phân lập tế bào lympho từ máu ngoại vi sử
dụng Ficol paque của GE LIFE SCIENCE
https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/13 14729545976/litdoc71716700AG_20110830221438.pdf) và theo Bøyum A (1974).
Phương pháp xác dịnh khả năng kích thích miễn dịch thơng qua tăng sinh tế bào lympho:
Được thực hiện theo phương pháp xác định khả năng tăng sinh tế bào nhờ MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) của Mosmann và cs (1983) và Scudiero AD và cs (1988). Về nguyên lí, tế bào lympho phân lập trực tiếp là những tế bào thường, khơng cĩ khả năng tăng sinh và bất tử nên sẽ chết sau 1-2 ngày nuơi cấy in vitro. Ngồi ra, MTT dưới tác động của hệ
enzyme của ti thể trong các tế bào sống và tăng sinh sẽ bị chuyển hĩa thành dạng formazan cĩ màu xanh tím. Do vậy, tế bào sống càng nhiều thì MTT được chuyển hĩa thành formazan nhiều, giá trị OD thu được càng lớn. Từ đĩ xác định được khả năng cảm ứng tăng sinh tế bào lympho của mẫu cần nghiên cứu.
2.3.4.2. Hoạt tính độc tế bào
Vật liệu nghiên cứu
Dịng tế bào ung thư: MCF7 (ung thư vú ở người); HepG2 (ung thư gan ở người) và SK-LU-1 (ung thư phổi ở người).
Mơi trường nuơi cấy tế bào là DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s medium) và các hĩa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco, Invitrogen v.v
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuơi cấy tế bào in vitro: Được thực hiện theo thường quy nuơi cấy của Ngân hàng tế bào Mỹ - American Type Cell Collection (ATCC - Manassas, VA 20110 USA).
Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào tế bào in vitro: Được thực hiện theo phương pháp của Monks và cs. (1991). Phương pháp này được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất cĩ khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein. Do đĩ lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM
3.1.Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside
3.1.1. Phân lập các auronol glucoside từ lá cây Chay Bắc Bộ (A. tonkinensis) và điều chế maesopsin điều chế maesopsin
3.1.1.1. Phân lập maesopsin 4-O-β-D-glucopyranoside (TAT2); alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT6) D-glucopyranoside (TAT6)
Mẫu lá cây Chay Bắc bộ (Artocarpus tonkinensis A. Chev.) thu hái ở chùa Nam Dư Hạ, Mai Động được phơi khơ nghiền nhỏ và được phân lập TAT2 và TAT6 với quy mơ 10 kg lá khơ/mẻ theo sơ đồ dưới đây:
Mẫu lá cây Chay Bắc bộ khơ (10 kg) được nghiền nhỏ và ngâm, chiết trong EtOH 85% ( 1 × 22 L + 3 × 12 L) ở nhiệt độ phịng. Quá trình chiết mẫu được lặp lại 4 lần để đảm bảo mẫu được chiết hết (kiểm tra bằng SKLM). Gộp các dịch chiết lại rồi quay cất dưới áp suất thấp loại dung mơi thu được cao ethanol (1,84 kg). Cặn này được hịa vào H2O (2 L), chiết với n-hexan. Dịch nước được chạy qua sắc ký
cột diaion HP-20 với dung mơi rửa giải MeOH/H2O ở các tỉ lệ 0/100; 50/50 và 100/0 (v/v) thu được 3 phân đoạn PA1, PA2 và PA3. Phân đoạn PA2 được chạy cột diaion tiếp tục với dung mơi rửa giải MeOH/H2O (50/50, v/v) thu được 100 g và được phân lập bằng SKC trên silica gel với hệ dung mơi rửa giải EA/MeOH/H2O (13/7/1, v/v/v) thu được 4 phân đoạn PB1, PB2, PB3, PB4. Phân đoạn PB2 được phân lập tiếp bằng SKC trên silica gel với hệ dung mơi rửa giải EA/MeOH/H2O (13/7/1, v/v/v) thu được PC1 (10 g), PC1 được phân lập tiếp bằng SKC pha đảo với hệ dung mơi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4, 1/7, 1/9) thu được 7 g TAT2 sạch. Phân đoạn PB3 được phân lập bằng SKC trên sephadex 2 lần với dung mơi MeOH thu được PC2 (0,5 g), sau đĩ PC2 được phân lập tiếp bằng SKC pha đảo với hệ dung mơi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4, 1/7, 1/9), quá trình được lặp lại 3 lần thu được TAT6 sạch (0,03 g).
Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT6)
ESI-MS (negative): m/z = 465 [M-H]ˉ . 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,66/6,67 (1H, 2 × d, J = 2,5 Hz, H-2′), 6,57/6,55 (1H, 2 × d, J = 8,5 Hz, H- 5′), 6,52/6,51 (1H, 2 × dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-6′), 6,00/5,98 (1H, 2 × d, J =1,2 Hz, H-5), 5,88/5,87 (1H, 2 × d, J = 1,2 Hz, H-7), 4,88 (1H, tín hiệu chồng chập, H-1′′), 3,88 (1H, br d, J = 12,5 Hz, Hb-6′′), 3,70 (1H, m, Ha-6′′), 3,53 (1H, dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2′′), 3,48 (1H, m, H-3′′), 3,43 (2H, m, H-4′′ và H-5′′), 3,04 (2H, m, CH2-10). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,0/195,8 (C=O), 174,9/174,7 (C- 8), 174,8/174,6 (C-6), 158,4/158,3 (C-4), 145,6/145,5 (C-3′), 145,1 (C-4′), 126,5/126,4 (C-1′), 123,1/123,0 (C-6′), 118,7/118,6 (C-2′), 115,9/115,8 (C-5′),
107,6/107,5 (C-2), 102,4/102,3 (C-1′′), 101,7/101,5 (C-9), 99,0/98,3 (C-5), 94,0/93,8 (C-7), 78,3/78,2 (C-5′′), 77,3 (C-3′′), 74,1/74,0 (C-2′′), 71,1 (C-4′′), 62,2 (C-6′′), 42,3/42,2 (C-10).
Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT2)
ESI-MS (m/z): 449[M-H]ˉ . 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ (ppm) 9,14 (OH), 7,56, 7,52 (1 × OH), 6,93/6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′,6′), 6,56/6,54 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′,5′), 6,00 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 5,93 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 5,20, 5,13, 5,06, 5,01 (4 × OH), 4,97/4,90 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′′), 4,59/4,50 (1 × OH), 3,64/3,63 (1H, br m, Ha-6′′), 3,48 (1H, m, Hb-6′′), 3,29 - 3,20 (m, H-3′′, H-5′′, H-2′′, H-4′′), 2,96 và 2,90 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz, CH2-