huyết tương chó
a, Xây dựng phương pháp
+ Xử lý mẫu: Mẫu huyết tương được khảo sát xử lý theo 2 phương pháp: Chiết lỏng - lỏng và kết tủa protein. Phương pháp tủa protein có nhiều ưu điểm như tiến hành đơn giản, sử dụng dung môi ít và kinh tế. Vì vậy, chọn phương pháp tủa protein như phần 2.2.3.1.a.
+ Điều kiện sắc ký: Định lượng MH theo phương pháp HPLC với các điều kiện ghi trong phần 2.2.3.1.a. Để đảm bảo độ tin cậy cho kết quả phân tích trong huyết tương, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng MH trong huyết tương theo hướng dẫn của FDA và qui định trong Dược điển Mỹ.
b, Thẩm định phương pháp
* Độ đặc hiệu – chọn lọc
+ Xác định độ phù hợp của hệ thống sắc ký:
Tiêm lặp lại 6 lần vào hệ thống HPLC dung dịch chứa MH chuẩn và nội chuẩn RAN trong huyết tương chó đã xử lý với nồng độ tương ứng là 0,05 µg/ml và 7,5 g/ml (nồng độ trong mẫu nội chuẩn làm việc). Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.47.
Bảng 3.47. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký (n = 6)
STT Metformin (0,05 µg/ml) Ranitidin (7,5 g/ml)
tR (phút) Diện tích (mAU.s) tR (phút) Diện tích (mAU.s)
1 4,35 3035 3,336 67523 2 4,367 3035 3,34 68062 3 4,512 2985 3,343 68704 4 4,511 3026 3,342 69103 5 4,529 2993 3,346 67340 6 4,532 3096 3,348 68942 X 4,467 3028 3,343 68279 SD 0,085 39 0,0043 748 RSD (%) 1,892 1,304 0,128 1,096
Kết quả ở bảng trên cho thấy: Giá trị RSD của thời gian lưu; diện tích pic MH và RAN đều nhỏ hơn 4 % (cao nhất là 1,892 % và thấp nhất là 0,128 %). Như vậy, hệ thống HPLC sử dụng ổn định và phù hợp để tiến hành định lượng các mẫu chứa MH.
+ Đánh giá độ chọn lọc - đặc hiệu của phương pháp:
Kết quả phân tích sắc kí đồ được thể hiện ở hình 3.15 và 3.16.
Hình 3.15. Sắc ký đồ huyết tương trắng(a), huyết tương có chứa nội chuẩn (b) và huyết tương có chứa chuẩn và nội chuẩn (c)
c
3.107 Peak 1227.9 227.9 322.7 391.8 AU 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 nm 200.00 250.00 300.00 350.00 3.092 Peak 1 233.8 AU 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 nm 200.00 250.00 300.00 350.00
Hình 3.16. Phổ hấp thụ của các pic có tR=3,33 phút (ranitidin - a) và tR=4,26 phút (metformin - b)
Trên sắc đồ mẫu chuẩn xuất hiện 2 pic được xác định là MH và RAN; mẫu trắng không có pic tại các vị trí này. Dựa vào kết quả phổ hấp thụ của 2 pic đo bằng detector PDA cho thấy 2 pic này là RAN và MH.
Tiến hành khảo sát đô ̣ đă ̣c hiê ̣u và đô ̣ cho ̣n lo ̣c của phương pháp, kết quả đươ ̣c thể hiê ̣n ở bảng 3.48 dưới đây.
Bảng 3.48. Kiểm tra độ đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp
STT
Diện tích pic mẫu trắng (mAU.s) Tỷ lệ đáp ứng pic
tR từ 3,1 – 3,7 phút tR từ 4,0 – 4,4 phút Trắng/ Metformin Trắng/ Ranitidin 1 - - < 20% < 5% 2 - - < 20% < 5% 3 276 276 < 20% < 5% 4 - - < 20% < 5% 5 652 652 < 20% < 5% 6 - - < 20% < 5% ( “-“: không có tín hiệu đáp ứng)
Kết quả ở bảng 3.48 cho thấy: Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của MH (4,26 phút), đáp ứng pic của mẫu trắng ≤ 20 % diện tích pic của mẫu chuẩn (diện tích pic trung bình của mẫu chuẩn MH có nồng độ gần LLOQ là 3028 mAU.s). Trong khoảng thời gian lưu từ 3,1 đến 3,7 phút, diện tích pic mẫu trắng ≤ 5% diện tích pic nội chuẩn (diện tích pic RAN trung bình là 68279 mAU.s ở bảng 3.47). Như vậy, phương pháp phân tích đảm bảo nhâ ̣n
diê ̣n, phân biê ̣t đươ ̣c MH với nô ̣i chuẩn RAN và không bi ̣ ảnh hưởng bởi các ta ̣p chất có trong huyết tương, có đô ̣ cho ̣n lo ̣c đa ̣t yêu cầu.