metformin trong huyết tương chó
a, Xây dựng phương pháp
Xử lý mẫu huyết tương: Tham khảo các tài liê ̣u và nghiên cứu đã công bố, tiến hành khảo sát để lựa cho ̣n dung môi và điều kiê ̣n chiết tách MH từ huyết tương chó, cụ thể: Lấy 0,2 ml huyết tương chó (mẫu trắng/chuẩn/thử) cho vào ống ly tâm. Thêm 50 µl dung dịch RAN 7,5µg/ml (nội chuẩn ) và 50 µl nước cất; 0,4 ml dung dịch acetonitril, lắc xoáy 30 giây. Sau đó, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy dịch nổi, lọc qua màng lọc 0,45
m. Dịch lọc thu được dùng để tiêm sắc ký.
Điều kiê ̣n sắc ký:
+ Cột Fortis Phenyl (150 x 4,6 mm), đường kính hạt 5 m + Nhiệt độ cột: 25 0C, tốc độ dòng 1,0 ml/phút
+ Pha động: Acetonitril – đệm Na2HPO4 0,02M (pH 7) tỷ lê ̣ 60:40 (v/v) + Detector UV đo ở bước sóng 232 nm
+ Thể tích tiêm mẫu: 50 l, nội chuẩn RAN: Nồng độ 7,5 g/ml
b, Thẩm định phương pháp định lượng metformin trong huyết tương
Tiến hành thẩm đi ̣nh các tiêu chí theo hướng dẫn của FDA [41]: Thẩm định mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu kiểm chứng.
– Các dung dịch chuẩn và nội chuẩn:
+ Dung dịch chuẩn gốc (dung dịch A): Nồng độ chính xác khoảng 1000
g MH /100 ml methanol 50%.
+ Dung dịch nội chuẩn gốc (dung dịch B): Nồng độ chính xác khoảng 1500 g RAN/100 ml nước cất.
+ Dung dịch chuẩn làm việc (dung dịch A’): Từ dung dịch A, pha thành các dung dịch có nồng độ (0,2, 0,4, 0,8, 2, 4, 8 g/ml).
+ Dung dịch nội chuẩn làm việc (dung dịch B’): Từ dung dịch B, pha thành dung dịch có nồng độ 7,5 g/ml.
– Pha các mẫu:
+ Mẫu chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn và nội chuẩn làm việc (dung dịch A’ và B’) với huyết tương trắng để thu được các mẫu chuẩn có chứa nội chuẩn và chuẩn ở nồng độ thích hợp.
+ Mẫu trắng: Huyết tương trắng không chứa chuẩn và nội chuẩn (thay thể tích dung dịch chuẩn và nội chuẩn bằng thể tích dung môi tương ứng). + Mẫu zero: Huyết tương trắng không chứa chuẩn, chỉ chứa nội chuẩn (thay thể tích dung dịch chuẩn bằng thể tích dung môi tương ứng).
+ Mẫu kiểm chứng QC (Quality Control): Chuẩn bị tương tự như các mẫu chuẩn. Các mẫu QC chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc độc lập với dung dịch chuẩn gốc dùng để pha mẫu chuẩn. Mẫu LQC có nồng độ khoảng 0,15 µg/ml. Mẫu MQC có nồng độ khoảng 0,4 µg/ml. Mẫu HQC có nồng độ khoảng 1,5 µg/ml.
Các chỉ tiêu cần thẩm định gồm:
- Tính đặc hiệu – chọn lọc:
So sánh sắc kí đồ của ít nhất 6 mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương trắng có pha MH chuẩn ở nồng đô ̣ LLOQ (0,05 g/ml) và mẫu huyết tương trắng có pha MH chuẩn và nô ̣i chuẩn. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của MH phải không vượt quá 20 % đáp ứng của mẫu chuẩn. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của nội chuẩn phải không được vượt quá 5 % đáp ứng của nội chuẩn.
- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính:
Phân tích các mẫu chuẩn MH trong huyết tương có nồng đô ̣ khoảng 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 µg/ml theo quy trình đã đươ ̣c xây dựng. Xác đi ̣nh
sự tương quan giữa nồng đô ̣ MH trong huyết tương và tỷ lê ̣ diê ̣n tích pic chuẩn/nội chuẩn. Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp hồi qui trọng số [88], đường chuẩn phải có hệ số tương quan > 0,98 và ít nhất 75 % số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20 %.
- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):
Tiến hành sắc ký các mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ 1/10 – 1/30 nồng độ Cmax (khoảng 0,05 µg MH /ml huyết tương). Ghi lại đáp ứng pic của mẫu trắng và mẫu chuẩn. Nồng độ được coi là giới hạn định lượng dưới của phương pháp nếu trên sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ đó cho pic MH tách biệt với các pic tạp, có độ đúng từ 80 – 120 %; độ lặp lại với giá trị RSD ≤ 20 % và đáp ứng pic MH ≥ 5 lần đáp ứng của mẫu trắng.
- Độ đúng – độ lặp lại trong ngày, độ lặp lại khác ngày:
Tiến hành phân tích các mẫu kiểm chứng ở 3 mức nồng độ LQC (0,15 µg/ml), MQC (0,4 µg/ml) và HQC (1,5 µg/ml). Mỗi loa ̣i mẫu QC gồm ít nhất 5 mẫu đô ̣c lâ ̣p có cùng nồng đô ̣ và lă ̣p la ̣i trong 4 ngày khác nhau. Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký theo những điều kiê ̣n đã lựa cho ̣n. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị trung bình của các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lượng chuẩn đã cân và thể tích đã pha. Độ đúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %. Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày. Giá trị RSD phải ≤ 15 %.
- Hiệu suất chiết:
Xác định tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn và nội chuẩn bằng cách so sánh diện tích pic của MH và nội chuẩn từ mẫu huyết tương định lượng theo
phương pháp trên với diện tích pic của chúng trong mẫu pha động có chứa cùng nồng độ MH chuẩn hoặc nội chuẩn (RAN).
Tiến hành xử lý và sắc kí các mẫu MH ở nồng độ LQC, MQC, HQC và mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng là 0,15, 0,4 và 1,5 µg/ml có chứa RAN pha trong nền mẫu huyết tương đã được xử lý. Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi hiệu suất chiết không quá 110 % và không thấp hơn 30 %; RSD của giá trị hiệu suất chiết tại các nồng độ không quá 15 % và hiệu suất chiết trung bình tại các nồng độ khác nhau không quá 15 %. Tỷ lệ thu hồi được xác định bằng công thức: 100% S S H(%) C T f
Trong đó: ST: Diện tích pic RAN (MH) có trong mẫu đã qua chiết tách. Sc: Diện tích pic RAN (MH) của mẫu chuẩn pha trong pha động. f: Hệ số pha loãng.
- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc và nội chuẩn gốc:
+ Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc và nội chuẩn gốc trong thời gian ngắn: Chia dung dịch chuẩn và nội chuẩn gốc thành 2 phần: Một phần để ở điều kiện nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian tối thiểu 4 giờ; một phần bảo quản lạnh ở –80 ± 5 0C (MH) hoặc - 20 ± 5 0C (RAN). Xác định nồng độ MH và nội chuẩn có trong mẫu để ở nhiệt độ phòng và mẫu bảo quản lạnh.
+ Độ ổn định dài ngày của dung dịch chuẩn gốc và nội chuẩn gốc: Tiến hành nghiên cứu trên dung dịch chuẩn gốc MH bảo quản ở nhiệt độ – 80 ± 5
0C và dung dịch nội chuẩn gốc bảo quản ở nhiệt độ - 20 ± 5 0C. Phân tích xác định nồng độ ban đầu và sau 10 – 15 ngày bảo quản. So sánh thống kê (t-test) để đánh giá mức độ ổn định của mẫu ở điều kiện bảo quản tương ứng.
- Độ ổn định của metformin trong huyết tương: Xác định độ ổn định của MH sau ba chu kỳ đông – rã đông; trong quá trình xử lý mẫu và trong quá trình bảo quản dài ngày trên các mẫu LQC và HQC.
+ Độ ổn định của MH trong huyết tương sau ba chu kỳ đông- rã đông: Bảo quản các mẫu ở nhiệt độ - 20 ± 5 0C trong 24 giờ, lấy ra và để tan chảy ở nhiệt độ phòng. Sau khi đã tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 – 24giờ. Lặp lại chu kỳ đông – rã đông 2 lần nữa. Tiến hành phân tích mẫu sau lần để rã đông thứ 3. Kết quả lượng MH có trong mẫu sau 3 chu kỳ đông – rã đông phải tương đương với lượng MH có trong mẫu phân tích ngay sau khi để rã đông.
+ Độ ổn định của MH trong huyết tương trong quá trình xử lý mẫu: So sánh lượng MH có trong mẫu được chiết tách ngay sau khi rã đông và mẫu có nồng độ tương ứng chỉ được chiết tách sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng tối thiểu 4 giờ.
+ Độ ổn định dài ngày: Bảo quản mẫu ở - 20 ± 5 0C trong 15 đến 30 ngày. Nồng đô ̣ MH phải sai khác với nồng đô ̣ ban đầu không quá 15 % và giá tri ̣ RSD % giữa các kết quả đi ̣nh lượng ở mỗi nồng đô ̣ phải ≤ 15 %.