- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
4.4.1.Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC để định lượng metformin trong huyết tương chó
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN
4.4.1.Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC để định lượng metformin trong huyết tương chó
metformin trong huyết tương chó
Theo các hướng dẫn của FDA [41] và ASEAN [22] về thẩm định phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học bao gồm các chỉ tiêu tính chọn lọc, đặc hiệu; giới hạn định lượng dưới; xác định khoảng tuyến tính; xây dựng đường chuẩn nồng độ thuốc trong huyết tương chó và hàm đáp ứng; xác định độ đúng, độ chính xác; phần trăm tìm lại của phương pháp và độ ổn định của mẫu.
Quá trình chiết xuất dược chất từ dịch sinh học có thể thực hiện theo các phương pháp như chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn và tủa protein. Trong đó, phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn có thể cô đặc mẫu, làm tăng nồng độ dược chất trong mẫu định lượng do đó có thể phát hiện được dược chất ở nồng độ thấp. Tuy nhiên, phương pháp này phải thực hiện nhiều công đoạn, sai số lớn và cần các cột chứa chất mang đắt tiền. Trong số các nghiên cứu đánh giá SKD các dạng bào chế MH, có một số nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng [46], đa số các nghiên cứu còn lại sử dụng phương pháp tủa protein [17], [32],…Nhiều nghiên cứu sử dụng các dung môi như: acetonitril, methanol để tách protein huyết tương. Trong đó, tủa protein huyết tương bằng acetonitril đã được chứng minh hiệu quả trong việc loại trừ các chất nội sinh, có độ nhạy và độ tìm lại cao, phù hợp để áp dụng trong các nghiên cứu đánh giá SKD và tương đương sinh học [33].
Đề tài đã tiến hành khảo sát tủa protein bằng acetonitril và methanol, nhận thấy khi tủa bằng acetonitril nhanh hơn, đơn giản và loại được tạp chất trong mẫu huyết tương do đó lựa chọn acetonitril để xử lý mẫu trước khi định lượng.
Qua tham khảo các tài liệu đã công bố, lựa chọn phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC với detector UV để định lượng MH trong huyết tương chó hoàn toàn phù hợp với điều kiện trang thiết bị của Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự – Học viện Quân y và có giới hạn phát hiện phù hợp với việc định lượng MH trong huyết tương chó.
Kết quả khảo sát các cột sắc kí cho thấy: Cột pha đảo C18 Gemini, không tách được với các pic tạp trong huyết tương. Metformin bị đẩy ra sớm, cùng thời điểm với các tạp trong huyết tương khi sử dụng các pha động khác nhau. Cột Phenomenex Luna PFP 100A cũng cho kết quả tương tự. Cột pha thuận SphereClone 5µ SAX, MH tách tốt với các tạp khác trong huyết tương, nhưng các tạp trong huyết tương rải đều trên sắc ký đồ gây khó khăn cho việc lựa chọn
chất nội chuẩn. Cột Fortis Phenyl, cho thấy phần tạp huyết tương bị đẩy ra ngoài trong thời gian khoảng 2 phút, MH được đẩy ra chậm hơn, tách hoàn toàn với phần tạp trong huyết tương. Vì vậy, đề tài đã lựa chọn cột Fortis Phenyl để phân tích MH trong huyết tương chó.
Qua tham khảo các công trình nghiên cứu, cho thấy các tác giả sử dụng một số chất làm nội chuẩn trong định lượng MH trong dịch sinh học như: atenolol [32], clorpheniramin [62],… Khảo sát các nội chuẩn cho thấy: glipizid có khả năng tách tốt và được tách ra sớm hơn MH trong sắc ký đồ, nhưng trong quá trình sử dụng trong vài ngày, glipizid kém ổn định, không thích hợp làm chất nội chuẩn. Chlopheniramin có độ ổn định cao hơn, tách tốt với MH và các tạp huyết tương, nhưng khó phân tích cùng MH do thời gian lưu lớn, làm kéo dài thời gian phân tích. Nội chuẩn RAN có độ ổn định cao, thời gian lưu ngắn, thời gian phân tích mẫu chứa MH và RAN chỉ cần khoảng 7 phút, thích hợp cho nghiên cứu tương đương sinh học với số lượng mẫu phân tích rất lớn. Căn cứ vào khả năng tách pic và thời gian lưu hợp lý, lựa chọn RAN làm nội chuẩn.
Nhiệt độ cột, bước sóng và lưu lượng dòng lựa chọn lần lượt là 25 0C, detector UV đo tại 232 nm và 1,0 ml/phút cũng tương tự như điều kiện sắc kí của một số nghiên cứu đã công bố như: Valizadeh H. và cs. (2014) [101], Zhang C.L. và cs. (2010) [109].
Pha động gồm có acetonitril và đệm phosphat với pH đệm và tỷ lệ khác nhau cũng đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu về phương pháp định lượng MH trong dịch sinh học [11], [33], [109]. Đề tài đã lựa chọn pha động gồm: Acetonitril – đệm phosphat Na2HPO4 0,02M (pH 7,0) tỷ lệ 60:40 (v/v) đảm bảo tách pic tốt và thời gian lưu hợp lý.
Thẩm định phương pháp định lượng MH trong huyết tương chó theo các điều kiện sắc kí đã lựa chọn ở trên cho thấy phương pháp phân tích đạt các yêu cầu về độ chọn lọc – đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác. Độ tìm lại của phương pháp cao và ổn định. Giới hạn định lượng dưới được xác định là
0,05 µg/ml. Nồng độ MH trong huyết tương chó có tương quan tuyến tính với tỷ lệ diện tích pic MH/RAN trong khoảng 0,05–2,0 µg/ml, đường chuẩn có hệ số tương quan ≈ 1.
Mẫu huyết tương ổn định sau 3 chu kì đông – rã đông, trong quá trình xử lý mẫu (4 giờ ở nhiệt độ phòng) và khi bảo quản trong thời gian dài (27 ngày bảo quản ở - 20 ± 5 0C). Khoảng thời gian 27 ngày đủ để toàn bộ số mẫu của 6 chó nghiên cứu được phân tích hết.