Mẫu sinh học thường có nồng độ dược chất thấp, nền mẫu dịch sinh học rất phức tạp nên các phương pháp phân tích sắc kí có độ nhạy cao hay
được ứng dụng để định lượng dược chất trong mẫu. Tuỳ thuộc vào nồng độ, đặc tính lý hoá và khả năng hấp thụ UV – VIS,… của chất phân tích mà lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp. Trong đó, phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng phổ biến nhất. Phương pháp phân tích khối phổ đặc biệt là kỹ thuật sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS) vì có khả năng tăng nhạy và độ chọn lọc cao được sử dụng với những mẫu dịch sinh học có nồng độ dược chất thấp [5].
Metformin được sử dụng với hàm lượng lớn, nồng độ dược chất trong huyết tương cao và có độ nhạy cao với phương pháp HPLC nên được dùng trong hầu hết các nghiên cứu. Các điều kiện sắc kí phải được khảo sát để đạt được các yêu cầu của phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học theo quy định của FDA.
+ Pha động: Việc lựa chọn pha động trong phân tích HPLC giúp đảm bảo việc thu hồi hoạt chất. Trong các nghiên cứu định lượng metformin trong huyết tương, hỗn hợp gồm acetonitril và đệm phosphat được sử dụng nhiều với pH thay đổi từ 3,5 đến 7,5 [46], [62], [98], [108]. Vì acetonitril là dung môi hữu cơ rẻ tiền, sẵn có và cho hiệu suất chiết cao. Đồng thời, có thể lựa chọn dung dịch đệm phosphat có pH phù hợp để đảm bảo độ chọn lọc của phương pháp định lượng. Hỗn hợp acetonitril và đệm phosphat được phối hợp theo nhiều tỷ lệ khác nhau: (65:35) [17], (25:75) [32], (80:20) [62], (60:40) [101], [108]. Ngoài ra, một số hỗn hợp pha động khác cũng được lựa chọn như: Methanol và đệm phosphat [27]; acetonitril và amoni acetat [98].
+ Cột sắc ký: Cột pha đảo thường được dùng trong các nghiên cứu định lượng MH trong dịch sinh học là: C18 [98], [101] và cyano [17], [62], [108]. Ngoài ra, cột silica [33] và cột trao đổi ion [27] cũng được sử dụng.
+ Nhiệt độ cột: Nhiệt độ cột thường được duy trì ở 25 0C cho thấy thời gian lưu ngắn phù hợp với việc phân tích số lượng mẫu lớn.
+ Tốc độ dòng: Việc lựa chọn tốc độ dòng ảnh hưởng đến độ phân giải và thời gian chạy sắc kí. Tốc độ 1 ml/phút cho thấy phù hợp với nhiều pha động và pha tĩnh khác nhau [11], [32], [108]. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu khác lựa chọn tốc độ dòng chậm hơn như 0,5 ml/phút [98], 0,6 ml/phút [62] hoặc tốc độ dòng cao hơn như 1,2 ml/phút [89], 1,5 ml/phút [46] và 2,0 ml/phút [17].
+ Nội chuẩn: Nội chuẩn là chất có nồng độ xác định được thêm vào mẫu phân tích nhằm giảm sai số và tăng độ lặp lại của phương pháp định