Nhận xét đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm gen BRAF v600e ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp dưới 45 tuổi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN MINH NGUYỆT NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ XÉT NGHIỆM GEN BRAF V600E Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP DƯỚI 45 TUỔI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH HỌC Y ĐA KHOA HÀ NỘI - 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN MINH NGUYỆT NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ XÉT NGHIỆM GEN BRAF V600E Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP DƯỚI 45 TUỔI Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: TS.BS NGUYỄN QUANG HÙNG ThS.BS NGUYỄN ĐỨC LUÂN HÀ NỘI - 2021 LỜI CẢM ƠN Trước hết em xin trân trọng cảm ơn Đại học Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội, ban Giám đốc Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, bệnh viện Bạch Mai cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ – Bác sĩ Nguyễn Quang Hùng, Thạc sĩ - Bác sĩ Nguyễn Viết Luân người thầy tận tình giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập, trực tiếp hướng dẫn em làm nghiên cứu, đóng góp ý kiến q báu giúp em hồn thành khóa luận Em xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới thầy cô, bạn, người tạo điều kiện giúp đỡ em thực khóa luận, em xin cảm ơn Phó giáo sư – Tiến sĩ Phạm Cẩm Phương, Thạc sĩ - Bác sĩ Lê Viết Nam, Thạc sĩ - Bác sĩ Lê Quang Hiển, Võ Thị Thúy Quỳnh, toàn thể bác sỹ, điều dưỡng, kỹ thuật viên Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, bệnh viện Bạch Mai giúp đỡ em trình thu thập số liệu phục vụ cho nghiên cứu Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Đại học Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội người tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo điều kiện giúp đỡ em suốt năm qua Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ em trình thu thập số liệu phục vụ nghiên cứu Tuy nhiên kiến thức chun mơn cịn hạn hẹp thân cịn thiếu sót kinh nghiệm thực tiễn kiến thức chun mơn, nội dung khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận góp ý để khóa luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2021 Nguyễn Minh Nguyệt LỜI CAM ĐOAN Tên Nguyễn Minh Nguyệt, sinh viện khóa QH.2015.Y, ngành Y đa khoa, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội, xin cam đoan: Đây khóa luận thân trực tiếp thực hướng dẫn Tiến sĩ -Bác sĩ Nguyễn Quang Hùng, Thạc sĩ - Bác sĩ Nguyễn Đức Ln Cơng trình không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nôi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nghiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Minh Nguyệt Danh mục hình Hình 1.1 Tỷ lệ mắc chuẩn hóa ung thư phổ biến Việt Nam Hình 1.2 Sơ đồ bước khử biệt hóa ung thư tuyến giáp nguồn gốc tế bào nang giáp Hình 1.3 Siêu âm ung thư biểu mơ nhú tuyến giáp Hình 1.4 Hình ảnh nhân lạnh tuyến giáp xạ hình Tc-99m ghi máy SPECT Hình 1.5 Cắt lớp vi tính trường hợp UTTG Hình 1.6 PET/CT bệnh nhân UTTG tái phát Hình 1.7 Con đường tín hiệu MAPK Hình 1.8 Con đường tín hiệu đột biến gen BRAF V600E ung thư tuyến giáp Biểu đồ 3.1 Danh mục biểu đồ Lý vào viện Biểu đồ 3.2 Đặc điểm mô bệnh học Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E Bảng 3.1 Danh mục bảng Phân bố tuổi giới Bảng 3.2 Đặc điểm phương pháp vị trí lấy mẫu bệnh phẩm Bảng 3.3 Đặc điểm tiến triển khối u Bảng 3.4 Vị trí di hạch, di xa Bảng 3.5 Đặc điểm lâm sàng theo độ tuổi Bảng 3.6 Đặc điểm phương pháp kết điều trị Bảng 3.7 Mối liên quan đột biến gen BRAF V600E với đặc điểm nhân Bảng 3.8 Mối liên quan đột biến gen với vị trí lấy mẫu Bảng 3.9 Mối liên quan đột biến gen với mô bệnh học Bảng 3.10 Mối liên quan đột biến gen BRAF V600E với tiến triển khối u tuyến giáp Bảng 3.11 Mối liên quan đột biến gen BRAF với phương pháp điều trị Bảng 4.1 Một số nghiên cứu đột biến BRAF V600E MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ung thư tuyến giáp 1.1.1 Dịch tễ học 1.1.2 Nguyên nhân, yếu tố nguy 1.1.3 Đặc điểm ung thư giáp theo giải phẫu bệnh 1.1.4 Chẩn đoán 1.1.5 Chẩn đoán giai đoạn 12 1.2.6 Điều trị 14 1.2.7 Tiên lượng bệnh 17 1.2 Tổng quan đột biến gen BRAF V600E bệnh nhân ung thư giáp trạng 19 1.2.1 Đột biến BRAF V600E 19 1.2.2 Phương pháp phát đột biến gen BRAF V600E .22 1.3 Một số nghiên cứu mối liên quan đột biến BRAF V600E với UTTG nước 23 1.3.1 Trên giới: 23 1.3.2 Tại Việt Nam 24 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 27 CHƯƠNG 3, KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân Ung thư tuyến giáp 45 tuổi có xét nghiệm gen BRAF V600E 28 3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 28 3.1.2 Đặc điểm mô bệnh học 29 3.1.3 Đặc điểm giai đoạn tiến triển khối u 30 3.1.4 Phương pháp kết điều trị 32 3.2 Tình trạng đột biến gen BRAF V600E bệnh nhân ung thư tuyến giáp 45 tuổi 33 3.2.1 Tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E 33 3.2.2 Mối liên quan đột biến gen BRAF V600E số đặc điểm lâm sàng 33 CHƯƠNG BÀN LUẬN 38 4.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân UTTG 45 tuổi có xét nghiệm gen BRAF V600E 38 4.1.1 Đặc điểm lâm sàng 38 4.1.2 Đặc điểm mô bệnh học 39 4.1.3 Đặc điểm giai đoạn tiến triển bệnh 39 4.1.4 Đặc điểm phương pháp kết điều trị 42 4.2 Nhận xét tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E mối liên quan đột biến với đặc điểm lâm sàng 43 4.2.1 Nhận xét tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E .43 4.2.2 Nhận xét mối liên quan đột biến gen BRAF V600E với số đặc điểm lâm sàng 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư tuyến giáp (UTTG) bệnh ác tính hay gặp hệ nội tiết, đồng thời ung thư chiếm tỷ lệ cao số ung thư vùng đầu mặt cổ, chiếm 3,6% số tất loại ung thư giới [25] Theo GLOBOCAN 2020, có 586.000 ca mắc báo cáo, đứng thứ tỷ lệ mắc bệnh toàn cầu, đứng thứ số bệnh ung thư phụ nữ Tại Việt Nam, 100.000 dân có 4,8 người mắc UTTG [28] UTTG bệnh ung thư có tiên lượng tốt, tỷ lệ sống sau 10 năm lên tới 98-99% người trẻ tuổi (70 tuổi), tỷ lệ tử vong đạt ngưỡng 20-25% [55] Theo đó, Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ (AJCC) đưa độ tuổi yếu tố định tiên lượng bệnh ung thư tuyến giáp Cụ thể, AJCC phân loại bệnh nhân 45 tuổi có yếu tố nguy thấp, không phụ thuộc vào yếu tố khác [46] Bên cạnh đó, việc tìm hiểu ngun nhân bệnh sinh yếu tố ảnh hưởng diễn biến lâm sàng thực song song với phát triển phương pháp chẩn đoán điều trị bệnh Đột biến BRAF V600E phát chứng minh vai trị vấn đề nêu Đột biến phát từ năm 2000 tìm thấy 36-83% khối u tuyến giáp đồng thời dấu ấn quan trọng tiên lượng điều trị bệnh [50] Đột biến BRAF V600E chứng minh nguyên nhân hình thành ung thư qua đường tín hiệu MAPK Trong nghiên cứu gần đây, BRAF V600E chứng minh có mối liên quan với đặc điểm lâm sàng, trình diễn tiến bệnh, yếu tố tiên lượng kết điều trị Iod phóng xạ phương pháp điều trị bổ trợ cần thiết bệnh nhân UTTG Mối liên quan đột biến gen BRAF V600E với lâm sàng nghiên cứu, nhiên Việt Nam, có đề tài nghiên cứu vấn đề Vì chúng tơi thực đề tài “Nhận xét đặc điểm lâm sàng xét nghiệm gen BRAF V600E bệnh nhân ung thư tuyến giáp 45 tuổi” với hai mục tiêu: Nhận xét đặc điểm lâm sàng bệnh nhân ung thư tuyến giáp 45 tuổi có định xét nghiệm gen BRAF V600E Nhận xét tình trạng đột biến gen BRAF V600E mối liên quan đột biến gen BRAF V600E với đặc điểm lâm sàng bệnh nhân PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng đột biến gen BRAF V600E bệnh nhân ung thư tuyến giáp 45 tuổi Mã bệnh án: A/ Hành Họ tên bệnh nhân: ……………………………   Giới tính: Nam Nữ Tuổi: …………………………………………………………………… Nghề Nghiệp: ………………………………………….………………… Địa chỉ: ………………………………………….……………………… Liên hệ: ………………………………………….……………………… Ngày vào viện: ………………………………………….……………… Ngày viện: …………………………………………………………… B/ Chuyên môn 1.Thời gian phát hiện: …………………………………………………………… Triệu chứng lúc vào viện U cổ Sụt cân U tuyến giáp 3.1 3.2 Số lượng: ………………………………………….………………… Kích thước u: ………………………………………….……………… Vị trí:Thùy trái 3.3 Hạch cổ a Khơng có hạch cổ - Vị trí hạch cổ: Cùng bên   Di xa: a Không di Cận lâm sàng: 6.1 6.2 Phương pháp lấy mẫu: Phẫu thuật Vị trí lấy mẫu: Tuyến giáp 6.3 Loại mô bệnh học Thể nhú Thể tủy (tế bào C)  6.4 Xét nghiệm sinh học phân tử đột biến gen BRAF V600E:  Không đột biến Chẩn đoán 7.1 Chẩn đoán xác định: ………………………………………….…………… 7.2 Chẩn đoán giai đoạn: - Theo TMN     T (Tumor): T1 T2 T3 T4 N (Node):    N0 N1 Nx M    M1 M2 Mx (Metastasis):  Theo AJCC  Giai đoạn II Giai đoạn I   Giai đoạn III Giai đoạn IV Điều trị: 8.1 Phẫu Thuật: Cắt tuyến giáp toàn đơn Cắt tuyến giáp toàn nạo vét hạch Cắt thùy tuyến giáp Cắt eo giáp 8.2 Điều trị I-131: - Số lần: ………………………………………….………………… - Liều: Lần 1……… Lần 2………… Lần 3……………… 8.3 Điều trị hormon thay thế: Không  8.4 Xạ trị: Liều xạ: ………………………………………….……………  8.5 Hóa chất: Khơng Phác đồ điều trị: ………… Số đợt điều trị hóa chất: …………  Có   8.6 Điều trị đích: Khơng Có Thuốc: ………………………………………….………… Xạ hình tuyến giáp sau mổ: ………………………………………………………………………………… PHỤ LỤC 2: DANH SÁCH BỆNH NHÂN STT MÃ BỆNH ÁN HỌ VÀ TÊN TUỔI GIỚI TÍNH ĐỊA CHỈ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 XÁC NHẬN CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN PHỤ LỤC 3: PROTOCOL XÉT NGHIỆM THEO PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR ® (Theo kit cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test - Roche) Khuếch đại gen Chuẩn bị: ® + Thiết bị: hệ thống cobas z480, pipet kèm giá đỡ + Vật tư tiêu hao: đầu tip 10 200 µl có lọc, ống PCR + Đặt RXNMIX, BRAF OM, MGAC, BRAF MUT, BRAF WT, DNA khuôn lên đá lạnh Tiến hành: Chuẩn bị MasterMix sử dụng: RXNMIX = (Số mẫu + Controls + 1) × 10 µl BRAF OM = (Số mẫu + Controls + 1) ì àl MGAC = (S mu + Controls + 1) ì àl Chun bị đối chứng âm (NC) = 20µl BRAF WT + 20µl DNA SD Nồng độ mẫu DNA tham gia phản ứng ng/µl - Pha lỗng DNA DNA SD Phân phối 25 µl MMX vào đĩa AD Thêm 25 µl mẫu MC từ giếng A1 Thêm 25 µl mẫu NC từ giếng B1 Thêm 25 µl mẫu pha loãng từ loạt giếng C1 Dán kín đĩa AD miếng film Chuyển đĩa AD vào máy chạy theo chế độ phù hợp (đã cài đặt sẵn máy) PROTOCOL XÉT NGHIỆM THEO PHƯƠNG PHÁP PCR – LAI ĐẦU DÒ (Theo kit StripAssay ® – ViennaLab) Khuếch đại gen Chuẩn bị: - Thiết bị: máy PCR, pipet kèm giá đỡ - Vật tư tiêu hao: đầu tip 10 200 µl có lọc, ống PCR - Đặt Taq DNA Polymerase, Taq Dilution Buffer, DNA khuôn lên đá lạnh Tiến hành: Chuẩn bị phản ứng PCR: 15 μl Amplification Mix (nắp vàng) μl Taq Dilution Buffer 0,2 μl Taq DNA Polymerase μl DNA khuôn tổng hợp (nồng độ 1–10 ng/µl với mẫu mơ) Chuyển ống PCR vào máy chạy theo chế độ phù hợp (đã cài đặt sẵn máy) (Optional) Điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 3% Lai phát Chuẩn bị: - Thiết bị: pipet kèm giá đỡ, máy hút dịch chân không, bể ổn nhiệt (water bath), máy lắc điều nhiệt - Dụng cụ vật tư tiêu hao: đầu tip 10, 200 1000 µl, kẹp - Đưa máy lắc lên 45 o C - Đưa Hybridization Buffer Wash Solution A lên 45 o C - Đưa Teststrip, DNAT, Conjugate Solution, Wash Solution B, Colon Developer nhiệt độ phòng Chuẩn bị Typing Tray - Đánh dấu viền ngồi Teststrip bút chì (luôn di chuyển Teststrip kẹp sạch, không để tay trần tiếp xúc Teststrip) Tiến hành: Lấy 10 μl DNAT vào góc giếng sử dụng Typing Tray (đối với kit EGFR XLStripAssay® cần 20 μl DNAT) Thêm 10μl sản phẩm PCR, mix đều, giữ phút nhiệt độ phòng (đối với kit EGFR XL StripAssay® cần 10 μl sản phẩm PCR A B) Thêm 1ml Hybridization Bufer vào giếng, lắc nhẹ Đưa Teststrip vào giếng tương ứng, ủ 30 phút 45 o C, lắc khoảng 50 vòng/phút, loại dịch Chú ý: Luôn di chuyển Teststrip kẹp sạch, không để tay trần tiếp xúc Teststrip; đậy nắp water bath để tránh làm thay đổi nhiệt độ; bước cần tiến hành liên tục, không để Teststrip bị khô Thêm 1ml Wash Solution A, xả từ từ, loại dịch Thêm 1ml Wash Solution A, ủ lắc 45 o C 15 phút, loại dịch Lặp lại bước Thêm 1ml Conjugate Solution, ủ lắc nhiệt độ phòng 15 phút, loại dịch Thêm 1ml Wash Solution B, xả từ từ, loại dịch 10 Thêm 1ml Wash Solution B, ủ lắc nhiệt độ phòng phút, loại dịch 11 Lặp lại bước 10 12 Thêm 1ml Color Deverloper, ủ lắc 15 phút nhiệt độ phòng bóng tối 13 Rửa Test strips vài lần nước sạch, để khơ bóng tối Phân tích kết Dán teststrip Collector™ tương ứng Đặt Collector™ vào máy scan (chú ý mũi tên Collector™ tương ứng mũi tên máy scan) Kiểm tra đảm bảo dongle (USB chứa phần mềm) kết nối với máy tính Mở phần mềm StripAssay® Evaluator Trong phần Automatic Mode, nhấn , nhấn tiếp (phần mềm tự động scan Collector™ khoảng 5–10 giây) Trong tab Start / Acquisition, nhập tên người thực xét nghiệm vào ô Operator, nhập mã lô sản phẩm vào ô Assay Lot Number Trong tab Strips / Sample Info, dùng chuột di chuyển nhận dạng teststrip để phần mềm đọc kết xác (nếu đầu teststrip dấu chấm màu đỏ phần mềm khơng đọc kết teststrip đó) Trong tab Results, nhập mã bệnh phẩm vào ô Sample ID, đánh dấu chọn vào ô Detailed Summary phần Report Trong tab Reporting, nhấn để in kết phân tích PHỤ LỤC CÁC THANG ĐIỂM TIÊN LƯỢNG BỆNH AGES (patient Age, histologic Grade of tumor, tumor Extent, Size of primary tumor) AMES (patient Age, presence of distant Metastases, Extent, Size of tumor) Điểm tiên lượng = tuổi x 3,1 (nếu tuổi