Luận văn tốt nghiệp tìm hiểu quy trình phát hiện clostridium botulinum trong thịt

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, sống người ngày nâng cao thỉ điều mà họ quan tâm vệ sinh ăn uống Hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậu nghiêm ứọng đến sức khoẻ cộng đồng Điều không phổ biến Việt Nam mà nước khác ừên giới Một nguyên nhân gây tình ừạng diện mức cho phép vi sinh vật gây hại thực phẩm Đe có biện pháp phòng tránh, ngăn chặn làm giảm bớt số ca ngộ độc thực phẩm Mà diện chuẩn gây hại như: E Coli, Salmonella, Cỉostrỉdỉum tạo độc tố nhiễm vi sinh vật Bệnh ngộ độc botulism bệnh nhiễm độc độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát ứiển sinh độc tố Người ăn phải thức ăn có độc tố bị nhiễm độc Gần đây, vai trò bào tử vi khuẩn có mặt ừong thực phẩm có khả gây ngộ độc vấn đề nghiên cứu Là sinh viên trường, tầm hiểu biết có giới hạn lý thuyết, kinh nghiệm non nên không tránh khỏi thiếu sót Kính mong nhận đóng góp ý kiến quý Thầy, Cô để khóa luận em hoàn thiện Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Từ xa xưa, người biết đến sử dụng vi sinh vật ứng dụng vi sinh vật ứong thực phẩm Các trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm ứng dụng đặc tính sinh học chủng vi sinh vật Khi khoa học phát ừiển, biết rõ vai trò vi sinh vật, việc ứng dụng vi sinh vật ứong sản suất ngày rộng rãi có hiệu Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Và không mà người ứng dụng tất chủng vi sinh vật tồn tự nhiên Ngoài vi sinh vật có lợi có vi sinh vật có hại gây bệnh cho ừồng, động vật thủy hải sản ảnh hưởng tới người Hiện nay, xã hội phát ứiển mặt hàng thực phẩm phong phú tiện lợi cho người tiêu dùng lựa chọn Thực phẩm đóng hộp có thị trường nhiều người sử dụng Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại quan tâm đến vấn đề dự trữ loại thực phẩm nhà để đối phó với khó khăn xảy Một ứong thực phẩm thường dự trữ loại thực phẩm đóng hộp Nếu mua sử dụng loại đồ hộp không cẩn thận, người bị ngộ độc ăn phải mầm bệnh phát triển ứong loại thực phẩm Ngộ độc thường ghi nhận bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulỉnum có ứong đồ hộp, gọi ngộ độc botulism, gây tử vong Ngộ độc botulism bệnh ngộ độc thực phẩm mang tính chất cấp tính xảy nặng, phá hủy hệ thần kinh trung ương gây tử vong cao Bệnh thường xảy sau ăn loại thực phẩm dự trữ đóng hộp thịt hộp, cá hộp, pa tê, xúc xích, rau Bệnh ngộ độc botulism thường loại vi khuẩn Cỉostrỉdỉum botulỉnum type Ẩ B gây nên, vi khuẩn tiết độc tố botulin, ngoại độc tố có độc tính cao, cao hẳn độc tố Aílatoxin độc tố vi khuẩn khác So với độc tố gây bệnh uốn ván, mạnh gấp lần (liều gây chết độc tố uốn ván 0,250 mg botulin 0,035 mg) Mặc dù độc tố dễ bị phân hủy nhiệt độ cao, cần đun thực phẩm lên đến 100°c 10-30 phút thỉ độc tố bị phá hủy hoàn toàn Nhưng độc tố bền vững với men tiêu hóa Bệnh ngộ độc botulism bệnh nhiễm độc độc tố vi khuẩn c.botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát triển sinh độc tố Người ăn phải thức ăn có độc tố bị nhiễm độc Còn vi khuẩn thường không gây nên bệnh không Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT sinh sản ứong thể người Chính ta cần phải tìm hiểu toàn có liên quan đến vi sinh vật để sử dụng tối đa đặc tính có hại đề phòng ảnh hưởng chúng đem lại Với ý nghĩa thực tế vậy, tiến hành thực khóa luận “ Tìm hiểu quy trình phát Clostritridium botulinum thít” m 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu vi sinh vật gây bệnh thịt sâu tìm hiểu quy trình phát c.botulinum độc tố botulin vi khuẩn Sau đưa số biện pháp phòng ngừa kiểm soát vi khuẩn Và từ tìm ứng dụng chúng vào thực tiễn để đem lại lợi ích cho người 1.3 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo di truyền, hoạt động sinh lý, hoá học, yếu tố độc lực, chế gây độc ứng dụng tuyệt vời c.botulinum Khả gây bệnh vi sinh vật thực phẩm mối liên quan chúng với thực phẩm Nghiên cứu độc tố botulin vi sinh vật gây bệnh ứong thực phẩm nhằm ngăn ngừa độc tố Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Chương 2: TỐNG QUAN 2.1 Giói thiêu thit vê sinh an toàn thưc phẩm thit 2.1.1 Giá trị dinh dưỡng thịt Thịt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, thịt động vật máu nóng thịt lợn, thịt bò, thịt gia cầm có chứa nhiều acid amin cần thiết, chất béo, chất khoáng, vitamin số chất thơm hay gọi chất chiết xuất Thịt loại nói chung nghèo canxi, giàu photpho Tỉ lệ Ca/P thấp Thịt tất loài nói chung chứa nhiều nước, lượng nước lên tới 70- 75% Protein chiếm 15-20%, lượng lipid dao động nhiều (1-30%) tùy thuộc vào loại súc vật độ béo Glucid thịt có Lượng ứo khoảng 1% Giá trị sinh học protein thịt 74%, độ đồng hóa protein thịt 96-97% Trong thịt protein có giá trị sinh học cao, có colagen elastin loại protein khó hấp thu, giá trị dinh dưỡng thấp thành phần tryptophan cystein hai acid amin có giá ừị cao Loại tập trung nhiều phần thịt bụng, thủ, chân giò Colagen đun nóng chuyển thành gelatin chất đồng keo Còn elastin gần không bị tác dụng men phân giải protein Vì ăn vào thải nguyên dạng Trong thịt chứa lượng chất chiết xuất tan nước, dễ bay hơi, có mùi vị thơm đặc biệt, số lượng khoảng 1,5- 2% thịt Nó có tác dụng kích thích tiết dịch vị mạnh Các chất chiết xuất gồm có creatin, camosin (có nitơ) glycogen, glucose, acid lactic (không có nitơ) Khi luộc thịt phần lớn chất chiết xuất hòa tan vào nước làm cho nước thịt có mùi vị thơm ngon đặc hiệu Chất béo có tổ chức da, bụng, quanh phủ tạng, bao gồm axit béo no chưa no Các xịt béo no chủ yếu palmitic (25-30%) stearie (16- 28) Các acid béo chưa no chủ yếu oleic (35-43%), acid béo chưa no có nhiều mạch kép khoảng 2-7% Riêng mỡ Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT gà có 18% acid linoleic mỡ ngựa có 16% linolenic, acid béo chưa no cần thiết mà thể không tự tổng hợp Mỡ lợn lớp có nhiều acid béo chưa no lớp sâu chất khoáng, thịt nguồn photpho (116-117 mg%), kali (212-259 mg%) Fe ( 1,1-2,3 mg%) tập trung nhiều gan Vì yếu tố có Cu, Zn, Coban Lượng Canxi thịt thấp (10-15 mg%) Vitamin: Thịt nguồn vitamin nhóm B chủ yếu BI tập trung phần thịt nạc Các vitamin tan chất béo có gan, thận Ngoài ra, gan, thận, tim, não có nhiều colesteron photphatit Thịt gia cầm thuộc loại thịt trắng có nhiều protein, lipid, khoáng vitamin so với thịt đỏ [7] Hình 2.1 Hình ảnh thít 2.1.2 Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng thịt Thịt nguồn dinh dưỡng giàu lượng, thành phần thịt gồm có: nước, protein, glucid, lipid, chất trích ly chứa nitơ phi nitơ, chất khoáng, vitamin enzyme Tuy nhiên giá trị thịt phụ thuộc chủ yếu vào protein Protein có thành phần cân thích hợp tất acid amin cần thiết cho thể Hàm lượng lipid chứa ứong thịt Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT có ảnh hưởng định đến độ tăng lượng thịt, làm cho thịt vừa có giá ứị lượng cao vừa góp phần tăng hương vị thơm ngon thịt Các chất trích ly thịt kích thích ăn ngon miệng tiết dịch tiêu hoá Thành phần hóa học mồ thịt, gồm có: Mô cơ: 50 - 70%, Mô mỡ: - 20%, Mô xương: 15 - 22%, Mồ liên kết: 914% Ngoài có mô thần kinh mô máu Bảng 2.1: Tỷ lệ mô thịt heo ( % theo khối lượng) [5] Thít Mồ Mô mỡ Mô liên kết Mô xương • loai • 40- % mô 15- % 0,6- , % 0,8- % Sụn mô máu thịt heo 0,6- , % Bảng2.2: Thành phần dinh dưỡng lOOg thịt heo Thành phần hoá học thịt tuỳ thuộc vào giống, tuổi giết thịt vị trí miếng thịt thể (tỉ lệ mô cơ, mô mỡ, mô liên kết) Protein Lỉpỉd Glucỉd Béo 20,3 Trung bình 17,0 25,3 Gầy 14,5 37,0 6,8 Nước Tro 0,48 71,9 0,52 0,3 56,8 0,2 Trang 47,8 0,6 0,5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Bảng 2.3: Thành phần acid amin không thay thịt heo[5] STT Acỉd Amỉn Hàm lượng % protein Lysine 7,82 Methionine 2,53 Trytophan 1,44 Phoyllalanine 4,15 Threonine 5,16 Valine 5,17 Leucine 7,58 Isoleucine 4,99 Arginine 6,410 Histidine 3,2 10 Theo (Bảng 2.3) protein thịt chứa hầu hết acid amin không thay với lượng đáng kể đáp ứng nhu cầu acid amin ngày Khi vào thể protein phân giải tạo thành khoảng 20 loại acid amin Trong số loại acid amin có chứa loại acid amin không thay người Nó giúp cho thể người tổng hợp sản xuất tế bào cách tốt Do đó, thịt sản phẩm đặc biệt quan trọng ứong việc giúp thể phát triển, cần thiết phụ nữ mang thai người ứong giai đoạn dưỡng bệnh Ngoài ra, protein không thay thịt cần thiết để xây dựng mô phục hồi tế bào Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT mất, tham gia tạo thành enzyme, acid amin, hoocmon thể miển dịch Không có protein thể không tồn Trong thịt heo chứa hầu hết chất khoáng cần thiết cho thể trì hoạt động bỉnh thường trình sống cân áp suất thẩm thấu tế bào mô Ngoài ra, thịt heo chứa nhiều loại vitamin: Bl, B2, B6, pp nguyên liệu khác Tóm lại, hai thành phần protein lipid thịt chứa hàm lượng cao định giá trị dinh dưỡng thịt Hơn nữa, mùi vị màu sắc thịt có tác dụng kích thích tiêu hoá Do đó, phần thức ăn ngày thịt đóng vai trò đặc biệt quan trọng Tuy nhiên, cần lưu ý không nên ăn nhiều lượng thịt bữa ăn mà phải kèm theo loại rau để giảm hàm lượng chất đạm tích tụ thể sau ăn tạo cân cho thể 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thịt Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thịt điều kiện nuôi dưỡng, giới tính, tuổi giết thịt, giống loài yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thịt sau trình giết mổ trình vận chuyển, tồn trữ giết mổ 2.1.3.1 Quá trình vận chuyển - Tránh tác động môi trường làm cho vật hoảng sợ, thẳng thần kinh, gây tiêu hao chất dự trữ - Hạn chế va chạm học - Đảm bảo cung cấp đầy đủ nước cho vật 2.1.3.2 Tồn trữ -Tránh chất cặn bã thức ăn thừa nhiễm vào súc thịt sau giết mổ vật - Cho uống nước đầy đủ, không làm giảm trọng lượng thịt - Cho thú nghỉ ngơi thời gian 2.1.3.3 Giết mổ - Nếu thời gian lấy máu dài, tim suy yếu, máu ngưng chảy, thịt bị thâm có mùi vị Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT xấu - Ngoài yếu tố trên, phẩm chất thịt vật phụ thuộc nhiều vào mồi trường, bệnh lý thuốc điều trị bệnh hóa chất lạ có thức ăn Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT 2.1.4 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng nguyên liệu thịt tươi [9] ❖ Chọn thịt tươi mói, không bị đập nát, màu, mùi lạ Bảng 2.4: Cách lựa chọn thịt tươi o • • • STT CHỈ SỐ THIT TƯƠI • Màng khô Trạng thái bên - Màu sắc đỏ tươi đỏ sẫm, ả THIT KÉM TƯƠI VÀ ÔI • - Màng nhớt nhiều hay bắt đàu nhớt óng - Màu xanh nhạt thẩm, chí đen, không bóng - Mỡ màu tối, độ rắn giảm sút, mùi vị - Mỡ có màu sắc, độ rắn, mùi vị bình ôi thường - Mặt khớp có nhiều nhớt - Mặt khớp láng - Dịch hoạt đục - Dịch hoạt vết cắt - Màu sắc bình thường, sáng, khô.- Màu sắc kém, ướt - Khi ấn ngón tay, để lại vết lõm, sau Độ rắn -vàRắn chắc, đàn hồi cao đàn hồi -Lấy ngón tay ấn vào thịt, không để ứở bình thường, dính tay lại vết lõm, bỏ ngón tay -raThịt ôi vết lõm không ứở bình không bị dính thường được, dính nhiều Tủy Nước luộc - Nước luộc trong, mùi vị thơm - Nước luộc đục, mùi vị hôi ngon - Trên mặt lớp mỡ tách thành - Trên mặt nồi có lớp với vết mỡ vết nhỏ to - Thịt ôi nước luộc đục, mùi hôi, không vết mỡ -Bám chặt vào thành ống tủy, màu -Tủy róc khỏi ống tủy, màu tối đàn hồi màu nâu, mùi hôi Trang 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT khuẩn phát triển dính sau ủ ủ đĩa khô trước đem ủ nhằm tránh vi khuẩn phát triển dính sau ủ ủ đĩa 35°c ứong 48 điều kiện yếm khí ♦> Chọn khuẩn lạc vỉ khuẩn c.botulinum điển hình - Chọn: chọn lấy mẫu 10 khuẩn lạc điển hình vi khuẩn c.botulỉnum phát triển độc lập Những khuẩn lạc có đặc điểm gồ cao hay dẹt, nhẵn hay xù xì Chúng thường phát triển phân bố dàn trải có mép không Trên môi trường lòng đỏ trứng, chúng có bề mặt óng ánh kiểm ứa ánh sáng chiếu lệch góc Những vùng óng ánh trông giống lớp ngọc ứai, theo trước sau đường viền không điều khuẩn lạc Bên cạnh vùng ngọc trai khuẩn lạc c.botulinum loại c, D E thường bao quanh vùng kết tủa rộng (2-4mm), màu vàng Các khuẩn lạc loại A B thường có vùng kết tủa nhỏ Việc phân lập khuẩn lạc có tính tương đối khó khăn số thành viên định giống Clostridium khuẩn lạc có hình thái tương tự không sinh độc tố - Cấy khuẩn lạc vào môi trường dịch thể: sử dụng que cấy vòng để cấy khuẩn lạc c.botulinum loại E vào môi trường TPGY , khuẩn lạc sinh toxin khác vào môi trường gan băm hay môi trường thịt chín Sau đem ủ ngày, kiểm ứa tạo thành toxin - Phân lập giống thuần: cấy ria lại chủng loại toxin lên môi trường thạch lòng đỏ trứng, ủ đĩa 35°c ứong điều kiện yếm khí, đĩa ủ 35°c điều kiện hiếu khí Nếu khuẩn lạc điển hỉnh c.botuỉinum phát ừiển ừên đĩa thạch ủ yếm khí không phát triển đĩa ủ hiếu khí giống Nếu không phân lập c.botulỉnum từ Trang 43 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT ứong khuẩn lạc chọn có nghĩa mật độ phân bố chúng ứong hệ vi sinh vật hỗn họp thấp Tiếp tục cấy chuyền liên tiếp vào môi trường tăng sinh làm tăng số lượng chúng lên đủ phép phân loại Bảo vệ giống trạng thái bào tử tủ lạnh, hạt thủy tinh, đông lạnh hay đông khô 3.1.4.3 Phát độc tổ botulỉn Chuẩn bị mẫu : lấy phần mẫu để phát tế bào vi khuẩn c.botulỉnum sống, phần khác để kiểm tra độc tính Bảo quản phần mẫu lại tủ lạnh Ly tâm mẫu chứa chất rắn lơ lửng điều kiện lạnh sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính Chiết mẫu thực phẩm rắn với thể tích tương ứng dung dịch đệm gel-phosphate, pH= 6,2 Tẩm ướt chất đệm vào mẫu thực phẩm cối chày làm Ly tâm mẩu giã ừong điều kiện lạnh sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính Rửa dụng cụ chứa mẫu nghi có dính thực phẩm với vài ml dung dịch đệm tốt để tránh pha loãng toxin đến mức phát ❖ Xác định độc tính mẫu thực phẩm hay canh trường vi khuẩn - Xử lỷ với ừypỉn : có mặt độc tố vi khuẩn không phân hủy protein mẫu cần phải kích hoạt trypin để xác định Vỉ vậy, cần xử lý phần lỏng mẫu rắn sau ly tâm, hay mẫu lỏng, hay dịch môi trường thịt chín chúng vi khuẩn với trypin trước phát độc tính Không xử lý trypin với môi trường TPGY, vỉ môi trường chứa sẵn trypin xử lý tiếp với trypin làm giảm hoạt tính toxin kích hoạt mức cao nhờ trypin có sẵn môi trường Điều chỉnh pH phần mẫu lỏng 6,2 với dung dịch NAOH IN hay HC1 IN Thêm 0,2ml dung dịch trypin bão hòa ứong nước vào l,8ml phần mẫu lỏng, ủ dịch hỗn họp 35-37°C ứong giờ, trộn đều, Trang 44 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT để kiểm tra độc tính Để chuẩn bị dung dịch trypin, cho lgam trypin (Difco, 1:250) vào ống nghiệm thêm lOml nước cất, lắc hơ nóng nhẹ để hòa tan - Kiểm tra độc tỉnh: tiến hành test song song mẫu xử lý không xử lý với trypin (lặp đôi) Pha loãng phần mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn chưa xử lý đến 1:2 , 1:10 1:100 , dung dich đệm gel-phosphate Tiến hành pha loãng tương tự với mẫu loãng hay canh trường vi khuẩn xử lý với trypin Tiêm vào bụng chuột, theo cặp chuột, 0,5ml mẫu lỏng chưa pha loãng vào 0,5ml mẫu kiểm tra chưa xử lý độ pha loãng cách sử dụng ống tiêm hay 3ml với kim cỡ 25cm, l,6cm Lặp lại bước với mẫu xử lý với trypin (lặp đồi) Đun l,5ml mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn lOphút 100°c Làm lạnh tiêm 0,5 (chưa pha loãng) vào chuột theo cặp Chuột không chết, độc tố botulin có bị bất hoạt nhiệt - Quan sát tất chuột theo khoảng thời gian định 48giờ Ghi nhận triệu chứng thời gian chuột chết Triệu chứng ngộ độc chuột bắt đầu thường ứong 24 đầu tiên, lông xù lên, thở mạnh hồi, thể yếu dần, cuối liệt thở yếu hẳn chết Nếu chuột chết mà ừiệu chứng đủ chứng để kết luận độc tố botulin có chất lỏng tiêm vào chuột Đôi chuột chết họp chất độc có mẫu tiêm hay nhiễm trùng vết thương 3.2 Phương pháp đại xác định c.botulỉnum 3.2.1 Phương pháp Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 3.2.1.1 Khái niệm Trang 45 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Được sử dụng để phát độc tố hoạt tính sinh học dò tìm độc tố không tích cực Nguyên tắc phương pháp miễn dịch phản ứng kết họp tế bào (kháng nguyên) với kháng thể đặc hiệu Tín hiệu phản ứng miễn dịch nhận biết thông qua ngưng tủa hay kết dính kháng nguyên - kháng thể cách sử dụng kháng thể đánh đấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym) Phương pháp sử dụng cho hầu hết tất kháng nguyên với độ nhạy độ đặc hiệu cao Nguyên tắc kỹ thật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên đĩa giếng, có điện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên giữ lại ứên bề mặt giếng Các kháng nguyên phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym horseradish peroxydase hay alkaline phosphatese Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyem vào giếng, enzyme xúc tác thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu phát diện định lượng kháng nguyên 3.2.1.2 Quy trình thực ❖ Nguyên vật liệu - Máy đọc ELISA có bước sóng 405nm - Bản nhựa 96 giếng đáy phẳng (của hãng NƯNC, Denmark) - Pipetman loại 20, 200, 1000 microlit đầu typ tương ứng - Dung dịch TYG: Môi trường dịch thể Trypticase (Tryptic) Pepton-Glucose-Yeast Extrace với Trypsin ( TPGYT) - Hòa tan thành phần rắn môi trường cho vào ống nghiệm 20x150mm thể tích 15ml hay cho lOOml vào lọ dung tích 170ml có vạch chia Hấp tiệc trùng ống nghiệm 121°c 10 phút lọ ứong 15 phút 121°c pH=7 Bảo quản 5°c Thêm Tripsin nagy sử Trang 46 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT dụng - Mầu c botulinum - Mau chứa huyết thỏ có kháng thể TgG - Dung dịch đệm Bicabonate 0.05 M, 0.8g Na2CƠ3 + 1.47g NaHCƠ3 500ml nước cất pH =9.6 - 1% dung dịch đệm casein - Đệm NaCl 0.005%, tween 20 6.04g Trisbazo; 8,76g NaCl, thêm 900ml nước cất phân hủy Tris NaCl, điều chỉnh pH = 25°c với HC12M 50ml dung dịch tween 20 định mức tới vạch lít - Dung dịch đừng phản ứng H2SO4 0,3M pha loãng ❖ Các bước tiến hành ELISA > Chuẩn bị hỗn hợp dịch vi khuẩn - Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm môi trường TPGY Hoặc CMM 37°c Sau 24h sinh trưởng 37°c, 5ml môi trường cho vào môi trường thẩm tích bao gồm: 2.5 lít Peptone Protease 4%, 1% chiết nấm men, 1% dextrone - Điều chỉnh pH trung bỉnh đến 7.3 trước khử trùng - Môi trường ủ nhiệt độ phòng 10 ngày - Môi trường mặt ly tâm 18000 vòng ứong 20 phút - Chất lỏng lên bề mặt tách riêng đem đông lạnh với thể tích glycerol > Kỹ thuật ELISA xác định kháng thể đặc hiệu kháng Clostridium chất dịch mẫu » $ Chuẩn bị mẫu đổi chứng - Mau âm tính: giống với tấc thuốc trừ độc ( không pha loãng vồ trùng CMM & TPGY) Trang 47 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT - Mau dương tính kiểm tra độc tố chuẩn loại A, B, E, F pha loãng vô trùng CMM & TPGY (pH=7.6 nồng độ 2pg/ml) $ Chuẩn bị mẫu toxin dạng thô lọc - Bước l(gẳn bảng nhựa): cho mẫu chứa kháng thể IgG để kết họp với kháng nguyên mẫu pha loãng 1:500 ứong dung dịch đệm carbonate, pH=9.6 Cho lOOpl/giếng, ủ qua đêm 4°c Rửa lần dung dịch PBS-Tween 20 0.05% - Bước (gắn kháng nguyên): Cho 300|il mẫu chứa kháng nguyên với nồng độ 109 tế bào/ml) dạng siêu nghiền pha loãng nồng độ lOpg/lml dung dịch đệm PBST vào giếng bảng, ủ 60-90 phút 35°c Sau rửa bảng với dung dịch rửa PBS- Tween 0.05% (3-5) lần - Bước 3: Phủ bảng nhựa dung dịch PBS-sữa không béo 5% PBS-Tween 20 0.05% cho 300pl/giếng - Bước 4: Đem ủ mẫu chứa độc tố 2h, 35°c Rửa mẫu lần PBST - Bước 5: Thêm lOOpl/giếng biotin để pha loãng chứa kháng thể có gắn nhãn peroxidase, ủ 60 phút, ứong 35°c - Bước 6: Rửa mẫu với PBST loại bỏ phần không liên kết - Bước 7: Cho lOOpl chất TMB vào giếng, ủ ứong tủ ấm 37°c 15-30 phút, không rửa - Bước 8: Phản ứng dừng lại cho vào H2SO4 0.3M $ Đọc kết quả: - Đọc mắt thường nhờ bảng so màu - Đọc máy ELISA: Đọc kết bước sóng 405nm ghi nhận kết quả: Trang 48 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT ■ Kết thử nghiệm xem dương tính tỷ lệ mật độ quang (OD) thử nghiệm chứng âm >2.3 ■ Ngưỡng phản ứng = 2.3 X OD chứng âm ■ OD mẫu > OD ngưỡng: Dương tính ■ OD mẫu < OD ngưỡng: Âm tính Trang 49 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Chú ỷ: Giá trị OD hai giếng mẫu lệch gấp đôi cần xét nghiệm lại mẫu SANDVMCH ELISA ASSAY METHOD Copyrighi Elisa acsay com 1) 2) •% 3> IÝJ „Y, Coat ptate a capture antibody Y Add Sampie to vveỉl antigen bmdỉ to capture antibocty Mơnơcỉơnaỉ antitoơcty-cơatecỉ we/ỉ antibơdy Y Dttechng anbbody 3dded and bmds to anbgen Anttgơn bỉrtds J l±J Subs-trate added Substrate IS convetteđ by eniymo to déto ctáble form e-hnked socondary (2o) antibody «s ađded b»nds to detocting antibody tơ “V VV *r V" / ■ [A/tìStr ^ Suí>str&t& ỉs *3Ơơoct anơ cơnvơrteơ t>y ơnz:ymơ in tơ ơơỉơr prơduơt Enzym&-iink.&ơ monocionsi sntibocỉy ỈDĨrtds to immotìiii^eoỉ antỉgen f/gure Sandwich ELỈSA Hình 3.2 Phương pháp ELISA Trang 50 Antigen m substrate X \ ' * À 1A/ash — ) 4) antíbody enzyme-linked antibody KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT 3.3 Phương pháp PCR Tất chủng c.botulinum nuôi cấy ứong 10 ml Tryptose- Peptone-glucoseYeast extract (TPGY) ủ ứong điều kiện kỵ khí 37°c 24-48h, nuôi qua đêm (20 nhiệt độ tương ứng) Bướcl Chuẩn bị khuôn mẫu: Lấy ml dung dịch chứa tế bào từ môi trường, rửa với ml đệm TE (0,01 M Tris-HCl, EDTA 0,001 M ,PH 8.0) 37°c ngâm ml nước cất Ngoài tế bào riêng rẻ phân lập chủng vi khuẩn, ba hỗn hợp phân lập chứa c.botulinum thủy phân protein loại A, B F, c.botulinum không thủy phân protein loại B, E , F tất bốn huyết chuẩn bị cách trộn riêng rẻ tế bào phân lập Mọi tế bào phân lập đun nóng 99° c 10 phút để chia tế bào phát hành DNA vi khuẩn ly tâm phút 10.000 X g Một khối lượng lịil mặt sử dụng mẫu hỗn hợp PCR Tất đun nóng 99°c 10 phút nhằm phá vỡ tế bào tách chiết DNA c.botulỉnum Ly tâm phút 10.000 vòng/phút Khoảng Ịil dịch mặt sử dụng mẫu hỗn họp PCR Bước2 Mồi: Dựa công bố trình tự DNA gen BoNT, bốn cặp mồi với cụ thể cho hai loại c botulỉnum A, B, E, F thiết kế (Bảng 2) Trang 51 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Bảng 3.2: Mồi bắt cặp c.boíulinum Bảng 2: Môi cho multiplex PCR c.otulinum loại A, B, E F Loại Mồi Nhiệt Chuỗi ( - ’ ) Produrct Vị ừí Đ Ộ G C ừên Size (bp) (mã vùng) ( °C) Af CBMLA1 AGC TAC GGA GGC 52 63.9 AGC TAT GTT 782 1788-1808 (%) Ar BMLA2 2569-2548 63.4 205 434-453 638-619 64.5 45 156-175 63.7 45 544-525 63.6 43 185-194 64.1 50 727-708 63.3 55 CGT ATT TGG AAA GCT GAA 41 AAG G Bf CBMLB1 64.3 CAG GAG AAG TGG 50 AGC GAA AA Br CBMLB2 CTT GCG CCT TTG TTT TCT TG Ef CBMLE1 CCA AGA TTT TCA 389 TCC GCC TA Er CBMLE2 GCT ATT GAT CCA AAA CGG TGA Ff CBMLF1 CGG CTT CAT TAG 543 AGA ACG GA Fr CBMLF2 TAA CTC ccc TAG ccc GGT AT Trang 52 gen KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Bước PCR: PCR thực với 50 Ịil hỗn hợp phản ứng có chứa (0.1 mẫu, 0,3 pM mồi, 220 nM ứiphosphate deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 32 mM Tris-HCl (pH 8,4), 80 mM KC1, 4,8 mM MgCl, DNA polymerase Các sản phẩm PCR khuyếch đại xác định agarose gel 2% nhuộm màu với ethydium bromide Bước Đọc kết quả: Multiplex PCR tế bào c.botulỉnum loại A, B, E, F mang lại sản phẩm khuếch đại dự kiến (Bảng 3.2): loại A: 782 bp; loại B: 205 bp; loại E: 389 bp; loại F 543 bp (Hình 3.3) Hỗn hợp bị đình tế bào mang đoạn DNA tưomg ứng Các sản phẩm PCR hình dung rõ ràng gel agarose, từ 150bp đến 200bp khác biệt kích thước sản phẩm khuếch đại kích hoạt phân biệt mảnh vỡ dễ dàng mà không cần sử dụng độ phân giải cao agarose (í ]Ợ)Ộ -♦ $1$ -• MKI -♦ 12 * 150 Hình 3.3 Phương pháp điện Trang 53 > KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Multiplex PCR phát c GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT botulỉnum Đường 1: trọng lượng phân tử đánh dấu; 2: c botuỉỉnum loại A; 3: c botulỉnum loại B; 4: c botuỉinum loại E; 5: c botulinum loại F; 6: c botuỉỉnum thủy phân protein loại A, B F; 7: c botuỉỉnum không thủy phân protein loại B, E F; 8: c botulỉnum loại A, B, E, F; 9: tiêu cực kiểm soát Trang 54 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 4.1 Kết luận Botulism bệnh nguy hiểm xảy Mấy năm gần đây, quan FDA Hoa Kỳ CFIA Canada cảnh báo bệnh botulism cho lệnh thu hồi vài loại sản phẩm nhiễm khuẩn bày bán thị trường chẳng hạn Hot Dog Chili Sauce Castleberry’s Ford Cpy USA, Austex Hot Dog Chili Sauce, Kroger Hot Dog Chili Sauce, Chili French Style Green Beans Lakeside Foods, Bolthouse Farm 100% Carrot Juice (Canada), Hot Great Value Original Chili with Beans Tuy nhiên độc tố botulism có vài ứng dụng ích lợi y khoa trị liệu Độc tố A (BTXA) sử dụng để trị xáo trộn thần kinh gây co thắt cơ, bệnh chứng gây ngứa da (prurit cutané), đau vùng mặt (douỉeur myo/acỉale), tiết nhiều mồ hôi (hyperhỉdrose), nhức đầu (migraine) Gần đây, tình cờ lý thú lúc dùng Toxine để trị chứng mí mắt co thắt bất thường (bỉépharospasme) bệnh nhân, bác sĩ khám phá thêm tác dụng khác độc tố làm tan biến xóa bớt nếp nhăn mặt cách tạm thời Thế độc tố botulism nhảy vào lĩnh vực thẩm mỹ với xuất thuốc Botox® Cosmetic (toxinA), Myobloc (toxinB), Dysport Vistabel Tất bào chế từ độc tố botulism Botox giúp xoá bỏ nếp nhăn trán, hai bên khóe mắt gọi vết chân chim (patte d’oie, crows feet), khóe miệng, hai chân mày Nhưng lĩnh vực làm giàu cho thẩm mỹ làm giàu cho luật sư 4.2 Kiến nghị Sau hoàn thành khóa luận này, nhận thấy c.botuỉỉnum vi sinh vật nguy hiểm với tấc nhiễm độc tố botulism Trang 55 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Vì thế, c.botulinum độc tố botulism sử dụng làm vũ khí sinh học với sức lan tỏa hủy diệt mạnh hành tinh Thực phẩm nhiễm c.botuỉỉnum khó nhận biết cảm quan nhận biết qua biểu lâm sàn Chúng ta phải thực tốt biện pháp kiểm soát chúng độc tố vi khuẩn mạnh nhiễm tỷ lệ tử vong cao Cần tuyên truyền cho người dân hiểu biết nguy hại loại thực phẩm có khả nhiễm khuẩn c.botulỉnum Quản lý thực đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm tấc khâu chế biến bảo quản thực phẩm, cần có biện pháp xử lý vi phạm vệ sinh an toàn thực phẩm thích hợp nhằm đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng sức khỏe cộng đồng Tìm hiểu nguyên nhân biểu bệnh để xử lý kịp thời tránh hậu đáng tiếc xảy TÀI LIỆU THAM KHẢO ❖ PHẨN TIẾNG VIỆT [1] Bộ môn vi sinh - khoa Y - Đại học Y Dl2lợc TP HCM, 1996 Vi khuẩn học [2] TH.S PHẠM MINH NHựT, 2010 Bài giảng“ Phân tích đánh giả chất lượng thực phẩm [3] TH.S PHẠM MINH NHựT, 2010 Bài giảng“ Thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm ” [4] Lê Đình Hùng, 1998 Đại cương phương pháp kiểm tra vỉ sinh vật thực phẩm Trung tâm Tiêu Chuẩn Đo LDHỜng Chất LDHợng khu vực III, TP HCM [5] LDHơng Đức Phẩm, 2002 Vỉ sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm.Nhà xuất Trang 56 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Nông Nghiệp - Hà Nội [6] Trần Linh ThlMc, 2006 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất Giáo Dục [7] Nguyễn Ngọc Tuân, 2002 Vệ sinh thịt Nhà xuất Nông Nghiệp - TP HCM ❖ PHÀN TIẾNG NƯỚC NGOÀI [8] Clinical Verterỉnary Microbiologin [9] FAO,1992 Microbiological analysỉs ỉn the food centrol laboratory 10.P J Quinn cs, 1994 Clirical Verterỉaary Microbiology ❖ PHẦN TRANG WEB [11] http:// vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html [12] Clostridium botulinum: ecology and control in foods by Andreas H w Hauschild,Karen L Dodds Trang 57 [...]... 2.2.8.2 Phát hiện và điều trị Cách trực tiếp và hiệu quả nhất để xác định chẩn đoán lâm sàng của botulism trong phòng thí nghiệm là chứng minh sự hiện diện của chất độc trong huyết thanh hoặc phân của Trang 24 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT bệnh nhân hoặc ứong thực phẩm bệnh nhân tiêu thụ Hiện nay, phương pháp sử dụng rộng rải nhất để phát hiện chất độc là thử nghiệm trung hòa ở chuột, trong. .. cả trăm ngàn người) Nếu quy trình chế biến bảo quản không tốt trong chế biến thực phẩm (nhất là đồ hộp), thực phẩm có thể bị nhiễm vi khuẩn này Trang 18 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Phương pháp làm sôi kết hợp với điều áp có thể diệt được vi khuẩn Nha bào của vi khuẩn không phát ừiển trong những đồ hộp có hàm lượng đường cao như mật ong, sừô nhưng có khả năng phát ứiển khi vào đường... Trang 13 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT 2.2 Giới thiêu về C .botulinum 2.2.1 Giói thiệu chung C.Botulỉnum Giới (domain): Bacteria Ngành (phylum) : Fỉrmicutes -v i\ z • XJ»«Ý < Lớp (class): Clostridia ì* 1 i L1 A;Ã; * Bộ (ordo) : Clostridiaỉes Họ (familia) : Clostridiaceae Chi (genus) : Clostridium ^/1 Loài (species) : c Botulinum Hình 2.2 Clostridium botulinum 2.2.2 Lịch sử phát hiện cỳy... và pate gan, và các loại thịt, xúc xích, tôm hùm, thịt hun khói và cá muối Trang 33 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT Hình2.11 Đồ hộp và trái cấy nhiễm C .botulinum 2.2.11 Tình hình nhiêm C .botulinum trên thế giới và tại Việt Nam - Ở Hoa Kỳ nhiễm c .botulinum chủ yếu trong đồ hộp rau quả như: ớt, đậu xanh, súp, củ cải, măng tây, nấm, chín ô liu, rau bina, cá ngừ, thịt gà Gần đây, tại Hoa... để lâu Biểu hiện ngộ độc thường sau khi ăn 2 giờ đến 48 giờ có các dấu hiệu: buồn nôn, nôn, Trang 12 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT chóng mặt, nhức đầu, mệt mỏi, người bệnh khó thở và hôn mê Nếu không được điều trị và xử lý kịp thời tỷ lệ tử vong rất lớn 2.1.6.4 Ngộ độc thức ăn do vỉ khuẩn Escherỉchia colỉ (E.Coli) Vi khuẩn này có nhiều trong phân người và gia súc Trong quá trình chế... ức chế quá trình xuất bào của Trang 21 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT acetylcholine bị loại bỏ bằng cách khôi phục lại sự thay thế của phức họp protein SNARE Trang 22 SNAR (teuronuscưaí E vkinctio Proto.n o Motor s Norvo Syn3ptfc Vosicĩo ÌO®Q(ị 3 A Normal Neurotransmitter Release SNARE Vesicle and Proteins Form Terminal Complex Mombranes Fu$o : ìĩỉ -V ằ KHÓA LUẬN TỐT>mínu$ NGHIỆP GVHD:...KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT ❖ Chỉ tiêu hóa sinh( TCVN 7046 : 2002) - pH=5.5-6.2 NH3 < 35 mg / lOOg thịt Phản ứng H2 - Độ trong của nước luộc thịt cho phép hơi đục khi phản ứng với CuSƠ4 ❖ Chỉ tiêu vi sinh - Tổng số vi sinh vật hiếu khí 106 Cfu/g - E Coli 102 Cfu/g - Samonella 0 - B cereus 102 Cfu/g - Cỉostridium perỷringens 0 - Cỉostridium botulinum 0 2.1.5 Vệ sình... KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT HACCP đảm bảo vệ sinh và chất lượng an toàn thực phẩm, sữa có chứa sữa non colostrum giàu kháng thể ngừa bệnh tật - Thực phẩm nghi ngờ có vi khuẩn độc thịt nên đun sôi liên tục trong 2 giờ - Các đồ hộp thịt, cá thấy bị phòng thì loại ngay ♦♦♦ Các biện pháp kiểm soát - Các biện pháp để ngăn chặn botulism bao gồm giảm mức độ ô nhiễm vi sinh vật, quá trình. .. kinh botulinum (loại AG) được xác định là c botulinum Bằng chứng tồn tại số kiểu hình và kiểu gen đáng kể đã chứng minh sự đa dạng trong loài Điều này đã dẫn đến sự phân loại lại của c botulỉnum loại G giống như là một loài mới Argentinense clostridium Chửng c.botuỉinum không sản xuất ra chất độc botulin được gọi là sporogenes Clostridium Năm 2003 bộ gen của c .botulinum được công bố với công trình. .. botulinum 0 2.1.5 Vệ sình an toàn thực phẩm trên thịt Thịt là nguồn thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao, được xếp vào thức ăn nhóm I, đồng thời lại là thức ăn dễ chế biến dưới nhiều dạng món ăn ngon vì vậy nó là thức ăn thường gặp hàng ngày trong bữa ăn của nhân dân ta Nếu chúng ta sử dụng thịt không đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thì thịt trở nên gây hại cho người sử dụng Thịt có thể là nguồn lây các bệnh nhiễm ... phải tìm hiểu toàn có liên quan đến vi sinh vật để sử dụng tối đa đặc tính có hại đề phòng ảnh hưởng chúng đem lại Với ý nghĩa thực tế vậy, tiến hành thực khóa luận “ Tìm hiểu quy trình phát. .. “ Tìm hiểu quy trình phát Clostritridium botulinum thít” m 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu vi sinh vật gây bệnh thịt sâu tìm hiểu quy trình phát c .botulinum độc tố botulin vi khuẩn Sau đưa... chứa ứong thịt Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT có ảnh hưởng định đến độ tăng lượng thịt, làm cho thịt vừa có giá ứị lượng cao vừa góp phần tăng hương vị thơm ngon thịt Các