Tìm hiểu quy trình phát hiện Clostridium Botulinum trong thịtx

Tìm hiểu quy trình phát hiện Clostridium Botulinum trong thịtx Tìm hiểu quy trình phát hiện Clostridium Botulinum trong thịtx Tìm hiểu quy trình phát hiện Clostridium Botulinum trong thịtx luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, sống người ngày nâng cao điều mà họ quan tâm vệ sinh ăn uống Hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậu nghiêm trọng đến sức khoẻ cộng đồng Điều không phổ biến Việt Nam mà nước khác giới Một nguyên nhân gây tình trạng diện mức cho phép vi sinh vật gây hại thực phẩm Để có biện pháp phòng tránh, ngăn chặn làm giảm bớt số ca ngộ độc thực phẩm Mà diện chuẩn gây hại như: E.Coli, Salmonella, Clostridium tạo độc tố nhiễm vi sinh vật Bệnh ngộ độc botulism bệnh nhiễm độc độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát triển sinh độc tố Người ǎn phải thức ǎn có độc tố bị nhiễm độc Gần đây, vai trị bào tử vi khuẩn có mặt thực phẩm có khả nǎng gây ngộ độc vấn đề nghiên cứu Là sinh viên trường, tầm hiểu biết có giới hạn lý thuyết, kinh nghiệm non nên khơng tránh khỏi thiếu sót Kính mong nhận đóng góp ý kiến q Thầy, Cơ để khóa luận em hồn thiện Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Từ xa xưa, người biết đến sử dụng vi sinh vật ứng dụng vi sinh vật thực phẩm Các trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm ứng dụng đặc tính sinh học chủng vi sinh vật Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trị vi sinh vật, việc ứng dụng vi sinh vật sản suất ngày rộng rãi có hiệu Và khơng mà người ứng dụng tất chủng vi sinh vật tồn tự nhiên Ngồi vi sinh vật có lợi có vi sinh vật có hại gây bệnh cho trồng, động vật thủy hải sản ảnh hưởng tới người Hiện nay, xã hội phát triển mặt hàng thực phẩm phong phú tiện lợi cho người tiêu dùng lựa chọn Thực phẩm đóng hộp có thị trường nhiều người sử dụng Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại quan tâm đến vấn đề dự trữ loại thực phẩm nhà để đối phó với khó khăn xảy Một thực phẩm thường dự trữ loại thực phẩm đóng hộp Nếu mua sử dụng loại đồ hộp không cẩn thận, người bị ngộ độc ăn phải mầm bệnh phát triển loại thực phẩm Ngộ độc thường ghi nhận bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum có đồ hộp, cịn gọi ngộ độc botulism, gây tử vong Ngộ độc botulism bệnh ngộ độc thực phẩm mang tính chất cấp tính xảy nặng, phá hủy hệ thần kinh trung ương gây tử vong cao Bệnh thường xảy sau ăn loại thực phẩm dự trữ đóng hộp thịt hộp, Trang KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT cá hộp, pa tê, xúc xích, rau Bệnh ngộ độc botulism thường loại vi khuẩn Clostridium botulinum type A B gây nên, vi khuẩn tiết độc tố botulin, ngoại độc tố có độc tính cao, cao hẳn độc tố Aflatoxin độc tố vi khuẩn khác So với độc tố gây bệnh uốn ván, mạnh gấp lần (liều gây chết độc tố uốn ván 0,250 mg botulin 0,035 mg) Mặc dù độc tố dễ bị phân hủy nhiệt độ cao, cần đun thực phẩm lên đến 1000C 10-30 phút độc tố bị phá hủy hoàn toàn Nhưng độc tố bền vững với men tiêu hóa Bệnh ngộ độc botulism bệnh nhiễm độc độc tố vi khuẩn C.botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát triển sinh độc tố Người ǎn phải thức ǎn có độc tố bị nhiễm độc Cịn vi khuẩn thường khơng gây nên bệnh khơng sinh sản thể người Chính ta cần phải tìm hiểu tồn có liên quan đến vi sinh vật để sử dụng tối đa đặc tính có hại đề phòng ảnh hưởng chúng đem lại Với ý nghĩa thực tế vậy, tiến hành thực khóa luận “ Tìm hiểu quy trình phát Clostritridium botulinum thịt” 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu vi sinh vật gây bệnh thịt sâu tìm hiểu quy trình phát C.botulinum độc tố botulin vi khuẩn Sau đưa số biện pháp phịng ngừa kiểm sốt vi khuẩn Và từ tìm ứng dụng chúng vào thực tiễn để đem lại lợi ích cho người Trang KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT 1.3 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo di truyền, hoạt động sinh lý, hoá học, yếu tố độc lực, chế gây độc ứng dụng tuyệt vời C.botulinum Khả gây bệnh vi sinh vật thực phẩm mối liên quan chúng với thực phẩm Nghiên cứu độc tố botulin vi sinh vật gây bệnh thực phẩm nhằm ngăn ngừa độc tố Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu thịt vệ sinh an toàn thực phẩm thịt 2.1.1 Giá trị dinh dưỡng thịt Thịt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, thịt động vật máu nóng thịt lợn, thịt bị, thịt gia cầm có chứa nhiều acid amin cần thiết, chất béo, chất khoáng, vitamin số chất thơm hay gọi chất chiết xuất Thịt loại nói chung nghèo canxi, giàu photpho Tỉ lệ Ca/P thấp Thịt tất loài nói chung chứa nhiều nước, lượng nước lên tới 7075% Protein chiếm 15-20%, lượng lipid dao động nhiều (1-30%) tùy thuộc vào loại súc vật độ béo Glucid thịt có Lượng tro khoảng 1% Giá trị sinh học protein thịt 74%, độ đồng hóa protein thịt 96-97% Trong thịt ngồi protein có giá trị sinh học cao, cịn có colagen elastin loại protein khó hấp thu, giá trị dinh dưỡng thấp thành phần khơng có tryptophan cystein hai acid amin có giá trị cao Loại tập trung nhiều phần thịt bụng, thủ, chân giị Colagen đun nóng chuyển thành gelatin chất đơng keo Cịn elastin gần khơng bị tác dụng men phân giải protein Vì ăn vào thải nguyên dạng Trong thịt chứa lượng chất chiết xuất tan nước, dễ bay hơi, có mùi vị thơm đặc biệt, số lượng khoảng 1,52% thịt Nó có tác dụng kích thích tiết dịch vị mạnh Các chất chiết xuất gồm có creatin, carnosin (có nitơ) glycogen, glucose, acid lactic (khơng có nitơ) Khi luộc thịt phần lớn chất chiết xuất hịa tan vào nước làm cho nước thịt có mùi vị thơm ngon đặc hiệu Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT Chất béo có tổ chức da, bụng, quanh phủ tạng, bao gồm axit béo no chưa no Các xịt béo no chủ yếu palmitic (25-30%) stearie (1628) Các acid béo chưa no chủ yếu oleic (35-43%), acid béo chưa no có nhiều mạch kép khoảng 2-7% Riêng mỡ gà có 18% acid linoleic mỡ ngựa có 16% linolenic, acid béo chưa no cần thiết mà thể không tự tổng hợp Mỡ lợn lớp ngồi có nhiều acid béo chưa no lớp sâu Về chất khoáng, thịt nguồn photpho (116-117 mg%), kali (212-259 mg%) Fe ( 1,1-2,3 mg%) tập trung nhiều gan Vì yếu tố có Cu, Zn, Coban Lượng Canxi thịt thấp (10-15 mg%) Vitamin: Thịt nguồn vitamin nhóm B chủ yếu B1 tập trung phần thịt nạc Các vitamin tan chất béo có gan, thận Ngồi ra, gan, thận, tim, não có nhiều colesteron photphatit Thịt gia cầm thuộc loại thịt trắng có nhiều protein, lipid, khoáng vitamin so với thịt đỏ.[7] Hình 2.1 Hình ảnh thịt Trang KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT 2.1.2 Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng thịt Thịt nguồn dinh dưỡng giàu lượng, thành phần thịt gồm có: nước, protein, glucid, lipid, chất trích ly chứa nitơ phi nitơ, chất khoáng, vitamin enzyme…Tuy nhiên giá trị thịt phụ thuộc chủ yếu vào protein Protein có thành phần cân thích hợp tất acid amin cần thiết cho thể Hàm lượng lipid chứa thịt có ảnh hưởng định đến độ tăng lượng thịt, làm cho thịt vừa có giá trị lượng cao vừa góp phần tăng hương vị thơm ngon thịt Các chất trích ly thịt kích thích ăn ngon miệng tiết dịch tiêu hoá Thành phần hóa học mơ thịt, gồm có: Mơ cơ: 50 ÷ 70%, Mơ mỡ: ÷ 20%, Mơ xương: 15 ÷ 22%, Mơ liên kết: ÷ 14% Ngồi cịn có mơ thần kinh mơ máu Bảng 2.1: Tỷ lệ mô thịt heo ( % theo khối lượng)[5] Thịt Mô Mô mỡ Mô liên kết Mô xương loại Sụn mô máu thịt heo mơ 40÷ % 15÷ % 0,6÷ , % 0,8÷ % 0,6÷ , % Bảng2.2: Thành phần dinh dưỡng 100g thịt heo Thành phần hoá học thịt tuỳ thuộc vào giống, tuổi giết thịt vị trí miếng thịt thể (tỉ lệ mô cơ, mô mỡ, mô liên kết ) STT Protein Lipid Glucid Nước Tro Béo 20,3 6,8 0,48 71,9 0,52 Trung bình 17,0 25,3 0,3 56,8 0,6 Gầy 14,5 37,0 0,2 47,8 0,5 Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT Bảng 2.3: Thành phần acid amin không thay thịt heo[5] STT Acid Amin Hàm lượng % protein Lysine 7,82 Methionine 2,53 Trytophan 1,44 Phoyllalanine 4,15 Threonine 5,16 Valine 5,17 Leucine 7,58 Isoleucine 4,99 Arginine 6,410 10 Histidine 3,2 Theo (Bảng 2.3) protein thịt chứa hầu hết acid amin không thay với lượng đáng kể đáp ứng nhu cầu acid amin ngày Khi vào thể protein phân giải tạo thành khoảng 20 loại acid amin Trong số loại acid amin có chứa loại acid amin khơng thay người Nó giúp cho thể người tổng hợp sản xuất tế bào cách tốt Do đó, thịt sản phẩm đặc biệt quan trọng việc giúp thể phát triển, cần thiết phụ nữ mang thai người giai đoạn Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT dưỡng bệnh Ngoài ra, protein không thay thịt cần thiết để xây dựng mô phục hồi tế bào mất, tham gia tạo thành enzyme, acid amin, hoocmon thể miển dịch …Khơng có protein thể khơng tồn Trong thịt heo chứa hầu hết chất khống cần thiết cho thể trì hoạt động bình thường trình sống cân áp suất thẩm thấu tế bào mơ…Ngồi ra, thịt heo chứa nhiều loại vitamin: B1, B2, B6, PP nguyên liệu khác Tóm lại, hai thành phần protein lipid thịt chứa hàm lượng cao định giá trị dinh dưỡng thịt Hơn nữa, mùi vị màu sắc thịt có tác dụng kích thích tiêu hố Do đó, phần thức ăn ngày thịt đóng vai trị đặc biệt quan trọng Tuy nhiên, cần lưu ý không nên ăn nhiều lượng thịt bữa ăn mà phải kèm theo loại rau để giảm hàm lượng chất đạm tích tụ thể sau ăn tạo cân cho thể 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thịt Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thịt điều kiện ni dưỡng, giới tính, tuổi giết thịt, giống loài yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thịt sau trình giết mổ trình vận chuyển, tồn trữ giết mổ 2.1.3.1 Quá trình vận chuyển - Tránh tác động môi trường làm cho vật hoảng sợ, thẳng thần kinh, gây tiêu hao chất dự trữ - Hạn chế va chạm học - Đảm bảo cung cấp đầy đủ nước cho vật 2.1.3.2 Tồn trữ Trang KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT -Tránh chất cặn bã thức ăn thừa nhiễm vào súc thịt sau giết mổ vật - Cho uống nước đầy đủ, không làm giảm trọng lượng thịt - Cho thú nghỉ ngơi thời gian 2.1.3.3 Giết mổ - Nếu thời gian lấy máu dài, tim suy yếu, máu ngưng chảy, thịt bị thâm có mùi vị xấu - Ngoài yếu tố trên, phẩm chất thịt vật cịn phụ thuộc nhiều vào mơi trường, bệnh lý thuốc điều trị bệnh hóa chất lạ có thức ăn 2.1.4 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng nguyên liệu thịt tươi [9] Trang 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT - Cấy mẫu xử lý: sử dụng que cấy vòng cấy hay vòng dây cấy chứa đầy dịch mẫu xử lý theo phong cách lên mơi trường thạch - lịng đỏ trứng - gan thịt bê hay thạch – lịng đỏ trứng yếm khí để tách khuẩn lạc phát triển riêng lẻ Nếu cần thiết, pha lỗng mẫu đến mức cho khuẩn phát triển dính sau ủ Ủ đĩa khô trước đem ủ nhằm tránh vi khuẩn phát triển dính sau ủ Ủ đĩa 35 0C 48 điều kiện yếm khí  Chọn khuẩn lạc vi khuẩn C.botulinum điển hình - Chọn: chọn lấy mẫu 10 khuẩn lạc điển hình vi khuẩn C.botulinum phát triển độc lập Những khuẩn lạc có đặc điểm gồ cao hay dẹt, nhẵn hay xù xì Chúng thường phát triển phân bố dàn trải có mép khơng Trên mơi trường lịng đỏ trứng, chúng có bề mặt óng ánh kiểm tra ánh sáng chiếu lệch góc Những vùng óng ánh trông giống lớp ngọc trai, theo trước sau đường viền không điều khuẩn lạc Bên cạnh vùng ngọc trai khuẩn lạc C.botulinum loại C, D E thường bao quanh vùng kết tủa rộng (2-4mm), màu vàng Các khuẩn lạc loại A B thường có vùng kết tủa nhỏ Việc phân lập khuẩn lạc có tính tương đối khó khăn số thành viên định giống Clostridium khuẩn lạc có hình thái tương tự không sinh độc tố - Cấy khuẩn lạc vào môi trường dịch thể: sử dụng que cấy vịng để cấy khuẩn lạc C.botulinum loại E vào mơi trường TPGY , khuẩn Trang 46 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT lạc sinh toxin khác vào môi trường gan băm hay môi trường thịt chín Sau đem ủ ngày, kiểm tra tạo thành toxin - Phân lập giống thuần: cấy ria lại chủng loại toxin lên môi trường thạch lòng đỏ trứng Ủ đĩa 350C điều kiện yếm khí, cịn đĩa ủ 350C điều kiện hiếu khí Nếu khuẩn lạc điển hình C.botulinum phát triển đĩa thạch ủ yếm khí khơng phát triển đĩa ủ hiếu khí giống Nếu khơng phân lập C.botulinum từ khuẩn lạc chọn có nghĩa mật độ phân bố chúng hệ vi sinh vật hỗn hợp thấp Tiếp tục cấy chuyền liên tiếp vào môi trường tăng sinh làm tăng số lượng chúng lên đủ phép phân loại Bảo vệ giống trạng thái bào tử tủ lạnh, hạt thủy tinh, đông lạnh hay đông khô 3.1.4.3 Phát độc tố botulin Chuẩn bị mẫu : lấy phần mẫu để phát tế bào vi khuẩn C.botulinum sống, phần khác để kiểm tra độc tính Bảo quản phần mẫu cịn lại tủ lạnh Ly tâm mẫu chứa chất rắn lơ lửng điều kiện lạnh sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính Chiết mẫu thực phẩm rắn với thể tích tương ứng dung dịch đệm gel-phosphate, pH= 6,2 Tẩm ướt chất đệm vào mẫu thực phẩm cối chày làm Ly tâm mẩu giã điều kiện lạnh sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính Rửa dụng cụ chứa mẫu nghi có dính thực phẩm với vài ml dung dịch đệm tốt để tránh pha loãng toxin đến mức phát  Xác định độc tính mẫu thực phẩm hay canh trường vi khuẩn Trang 47 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT - Xử lý với trypin : có mặt độc tố vi khuẩn khơng phân hủy protein mẫu cần phải kích hoạt trypin để xác định Vì vậy, cần xử lý phần lỏng mẫu rắn sau ly tâm, hay mẫu lỏng, hay dịch mơi trường thịt chín chúng vi khuẩn với trypin trước phát độc tính Khơng xử lý trypin với mơi trường TPGY, mơi trường chứa sẵn trypin xử lý tiếp với trypin làm giảm hoạt tính toxin kích hoạt mức cao nhờ trypin có sẵn mơi trường Điều chỉnh pH phần mẫu lỏng 6,2 với dung dịch NAOH 1N hay HCl 1N Thêm 0,2ml dung dịch trypin bão hòa nước vào 1,8ml phần mẫu lỏng Ủ dịch hỗn hợp 35-37 0C giờ, trộn đều, để kiểm tra độc tính Để chuẩn bị dung dịch trypin, cho 1gam trypin (Difco, 1:250) vào ống nghiệm thêm 10ml nước cất, lắc hơ nóng nhẹ để hịa tan - Kiểm tra độc tính: tiến hành test song song mẫu xử lý không xử lý với trypin (lặp đơi) Pha lỗng phần mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn chưa xử lý đến 1:2 , 1:10 1:100 , dung dich đệm gel-phosphate Tiến hành pha loãng tương tự với mẫu loãng hay canh trường vi khuẩn xử lý với trypin Tiêm vào bụng chuột, theo cặp chuột, 0,5ml mẫu lỏng chưa pha loãng vào 0,5ml mẫu kiểm tra chưa xử lý độ pha loãng cách sử dụng ống tiêm hay 3ml với kim cỡ 25cm, 1,6cm Lặp lại bước với mẫu xử lý với trypin (lặp đôi) Đun 1,5ml mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn 10phút 1000C Làm lạnh tiêm 0,5 (chưa pha loãng) vào Trang 48 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT chuột theo cặp Chuột không chết, độc tố botulin có bị bất hoạt nhiệt - Quan sát tất chuột theo khoảng thời gian định 48giờ Ghi nhận triệu chứng thời gian chuột chết Triệu chứng ngộ độc chuột bắt đầu thường 24 đầu tiên, lông xù lên, thở mạnh hồi, thể yếu dần, cuối liệt thở yếu hẳn chết Nếu chuột chết mà khơng có triệu chứng khơng có đủ chứng để kết luận độc tố botulin có chất lỏng tiêm vào chuột Đơi chuột chết hợp chất độc có mẫu tiêm hay nhiễm trùng vết thương 3.2 Phương pháp đại xác định C.botulinum 3.2.1 Phương pháp Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 3.2.1.1 Khái niệm Được sử dụng để phát độc tố hoạt tính sinh học dị tìm độc tố khơng tích cực Ngun tắc phương pháp miễn dịch phản ứng kết hợp tế bào (kháng nguyên) với kháng thể đặc hiệu Tín hiệu phản ứng miễn dịch nhận biết thơng qua ngưng tủa hay kết dính kháng nguyên - kháng thể cách sử dụng kháng thể đánh đấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym) Phương pháp sử dụng cho hầu hết tất kháng nguyên với độ nhạy độ đặc hiệu cao Nguyên tắc kỹ thật ELISA sử dụng kháng thể đơn dịng phủ bên ngồi đĩa giếng, có điện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên giữ lại bề mặt giếng Các kháng nguyên phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym horseradish peroxydase hay alkaline phosphatese Khi bổ sung Trang 49 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT chất đặc hiệu enzyem vào giếng, enzyme xúc tác thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu phát diện định lượng kháng nguyên 3.2.1.2 Quy trình thực  Nguyên vật liệu - Máy đọc ELISA có bước sóng 405nm - Bản nhựa 96 giếng đáy phẳng (của hãng NUNC, Denmark) - Pipetman loại 20, 200, 1000 microlit đầu typ tương ứng - Dung dịch TYG: Môi trường dịch thể Trypticase (Tryptic) – PeptonGlucose-Yeast Extrace với Trypsin ( TPGYT) - Hòa tan thành phần rắn môi trường cho vào ống nghiệm 20x150mm thể tích 15ml hay cho 100ml vào lọ dung tích 170ml có vạch chia Hấp tiệc trùng ống nghiệm 1210C 10 phút lọ 15 phút 121 0C pH=7 Bảo quản 50C Thêm Tripsin nagy sử dụng - Mẫu C.botulinum - Mẫu chứa huyết thỏ có kháng thể TgG - Dung dịch đệm Bicabonate 0.05 M, 0.8g Na2CO3 + 1.47g NaHCO3 500ml nước cất pH =9.6 - 1% dung dịch đệm casein - Đệm NaCl 0.005%, tween 20 6.04g Trisbazo; 8,76g NaCl, thêm 900ml nước cất phân hủy Tris NaCl, điều chỉnh pH = 250C với HCl 2M 50ml dung dịch tween 20 định mức tới vạch lít - Dung dịch đừng phản ứng H2SO4 0,3M pha loãng  Các bước tiến hành ELISA  Chuẩn bị hỗn hợp dịch vi khuẩn - Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm môi trường TPGY Hoặc CMM 370C Sau 24h sinh trưởng 37 0C, 5ml môi trường cho vào Trang 50 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT mơi trường thẩm tích bao gồm: 2.5 lít Peptone Protease 4%, 1% - chiết nấm men, 1% dextrone Điều chỉnh pH trung bình đến 7.3 trước khử trùng Mơi trường ủ nhiệt độ phịng 10 ngày Mơi trường mặt ly tâm 18000 vịng 20 phút Chất lỏng lên bề mặt tách riêng đem đông lạnh với thể tích glycerol  Kỹ thuật ELISA xác định kháng thể đặc hiệu kháng Clostridium chất dịch mẫu Y Chuẩn bị mẫu đối chứng - Mẫu âm tính: giống với tấc thuốc trừ độc ( khơng pha lỗng vơ trùng CMM & TPGY) - Mẫu dương tính kiểm tra độc tố chuẩn loại A, B, E, F pha lỗng vơ trùng CMM & TPGY (pH=7.6 nồng độ 2µg/ml) Y Chuẩn bị mẫu toxin dạng thô lọc - Bước 1(gắn bảng nhựa): cho mẫu chứa kháng thể IgG để kết hợp với kháng nguyên mẫu pha loãng 1:500 dung dịch đệm carbonate, pH=9.6 Cho 100µl/giếng, ủ qua đêm 40C Rửa lần dung dịch PBS-Tween 20 0.05% - Bước ( gắn kháng nguyên): Cho 300µl mẫu chứa kháng nguyên với nồng độ 109 tế bào/ml) dạng siêu nghiền pha loãng nồng độ 10µg/1ml dung dịch đệm PBST vào giếng bảng, ủ 60-90 phút 350C Sau rửa bảng với dung dịch rửa PBSTween 0.05% (3-5) lần - Bước 3: Phủ bảng nhựa dung dịch PBS-sữa khơng béo 5% PBS-Tween 20 0.05% cho 300µl/giếng - Bước 4: Đem ủ mẫu chứa độc tố 2h, 350C Rửa mẫu lần PBST Trang 51 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT - Bước 5: Thêm 100µl/giếng biotin để pha lỗng chứa kháng thể có gắn nhãn peroxidase, ủ 60 phút, 350C - Bước 6: Rửa mẫu với PBST loại bỏ phần khơng liên kết - Bước 7: Cho 100µl chất TMB vào giếng, ủ tủ ấm 370C 15-30 phút, khơng rửa - Bước 8: Phản ứng dừng lại cho vào H2SO4 0.3M Y Đọc kết quả: - Đọc mắt thường nhờ bảng so màu - Đọc máy ELISA: Đọc kết bước sóng 405nm ghi nhận kết quả:  Kết thử nghiệm xem dương tính tỷ lệ mật độ quang (OD) thử nghiệm chứng âm >2.3  Ngưỡng phản ứng = 2.3 x OD chứng âm  OD mẫu > OD ngưỡng: Dương tính  OD mẫu < OD ngưỡng: Âm tính Chú ý: Giá trị OD hai giếng mẫu lệch gấp đơi cần xét nghiệm lại mẫu Trang 52 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT Hình 3.2 Phương pháp ELISA 3.3 Phương pháp PCR Tất chủng C.botulinum nuôi cấy 10 ml TryptosePeptone-glucose- Yeast extract (TPGY) ủ điều kiện kỵ khí 37°C 24-48h, ni qua đêm (20 nhiệt độ tương ứng) Bước1 Chuẩn bị khuôn mẫu: Lấy ml dung dịch chứa tế bào từ môi trường, rửa với ml đệm TE (0,01 M Tris-HCl, EDTA 0,001 M ,PH 8.0) 37°C ngâm ml nước cất Ngoài tế bào riêng rẻ phân lập chủng vi khuẩn, ba hỗn hợp phân lập chứa C.botulinum thủy phân protein loại A, B F, C.botulinum không thủy phân protein loại B, E , F tất bốn huyết chuẩn bị cách trộn riêng rẻ tế bào phân lập Mọi tế bào phân lập đun nóng 990 C 10 phút để chia tế bào phát hành DNA vi khuẩn ly Trang 53 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT tâm phút 10.000 × g Một khối lượng 1μl mặt sử dụng mẫu hỗn hợp PCR Tất đun nóng 99 0C 10 phút nhằm phá vỡ tế bào tách chiết DNA C.botulinum Ly tâm phút 10.000 vòng/phút Khoảng μl dịch mặt sử dụng mẫu hỗn hợp PCR Bước2 Mồi: Dựa cơng bố trình tự DNA gen BoNT, bốn cặp mồi với cụ thể cho hai loại C botulinum A, B, E, F thiết kế ( Bảng 2) Bảng 3.2: Mồi bắt cặp C.botulinum Bảng 2: Mồi cho multiplex PCR C.otulinum loại A, B, E F Loại Mồi Nhiệt Chuỗi (5’ – 3’) Độ GC Produrct Size (bp) Af CBMLA1 AGC TAC GGA GGC 782 Vị trí gen (mã vùng) ( 0C) (%) 1788-1808 63.9 52 2569-2548 63.4 41 205 434-453 AGC TAT GTT Ar BMLA2 CGT ATT TGG AAA GCT GAA AAG G Bf CBMLB1 CAG GAG AAG TGG 64.3 50 Trang 54 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT AGC GAA AA Br CBMLB2 CTT GCG CCT TTG 638-619 64.5 45 156-175 63.7 45 544-525 63.6 43 185-194 64.1 50 727-708 63.3 55 TTT TCT TG Ef CBMLE1 CCA AGA TTT TCA 389 TCC GCC TA Er CBMLE2 GCT ATT GAT CCA AAA CGG TGA Ff CBMLF1 CGG CTT CAT TAG 543 AGA ACG GA Fr CBMLF2 TAA CTC CCC TAG CCC GGT AT Bước PCR: PCR thực với 50 μl hỗn hợp phản ứng có chứa 1μl mẫu, 0,3 μM mồi, 220 nM triphosphate deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 32 mM Tris-HCl (pH 8,4), 80 mM KCl, 4,8 mM MgCl, DNA polymerase Các sản phẩm PCR khuyếch đại xác định agarose gel 2% nhuộm màu với ethydium bromide Bước Đọc kết quả: Multiplex PCR tế bào C.botulinum loại A, B, E, F mang lại sản phẩm khuếch đại dự kiến (Bảng 3.2): loại A: 782 bp; loại B: 205 bp; loại E: 389 bp; loại F 543 bp (Hình 3.3) Hỗn hợp bị đình tế bào mang đoạn DNA tương ứng Các sản phẩm PCR hình dung rõ ràng gel agarose, từ 150bp đến 200bp khác biệt kích thước sản phẩm khuếch đại kích Trang 55 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT hoạt phân biệt mảnh vỡ dễ dàng mà không cần sử dụng độ phân giải cao agarose Hình 3.3 Phương pháp điện Multiplex PCR phát C botulinum Đường 1: trọng lượng phân tử đánh dấu; 2: C botulinum loại A; 3: C botulinum loại B; 4: C botulinum loại E; 5: C botulinum loại F; 6: C botulinum thủy phân protein loại A, B F; 7: C botulinum không thủy phân protein loại B, E F; 8: C botulinum loại A, B, E, F; 9: tiêu cực kiểm sốt Trang 56 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Botulism bệnh nguy hiểm xảy Mấy năm gần đây, quan FDA Hoa Kỳ CFIA Canada cảnh báo bệnh botulism cho lệnh thu hồi vài loại sản phẩm nhiễm khuẩn bày bán thị trường chẳng hạn Hot Dog Chili Sauce Castleberry’s Ford Cpy USA, Austex Hot Dog Chili Sauce, Kroger Hot Dog Chili Sauce, Chili French Style Green Beans Lakeside Foods, Bolthouse Farm 100% Carrot Juice (Canada), Hot Great Value Original Chili with Beans Tuy nhiên độc tố botulism có vài ứng dụng ích lợi y khoa trị liệu Độc tố A (BTXA) sử dụng để trị xáo trộn thần kinh gây co thắt cơ, bệnh chứng gây ngứa da (prurit cutané), đau vùng mặt (douleur myofaciale), tiết nhiều Trang 57 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT mồ hôi (hyperhidrose), nhức đầu (migraine) Gần đây, tình cờ lý thú lúc dùng Toxine để trị chứng mí mắt co thắt bất thường (blépharospasme) bệnh nhân, bác sĩ khám phá thêm tác dụng khác độc tố làm tan biến xóa bớt nếp nhăn mặt cách tạm thời Thế độc tố botulism nhảy vào lĩnh vực thẩm mỹ với xuất thuốc Botox® Cosmetic (toxinA), Myobloc (toxinB), Dysport Vistabel Tất bào chế từ độc tố botulism Botox giúp xoá bỏ nếp nhăn trán, hai bên khóe mắt cịn gọi vết chân chim (patte d’oie, crows feet), khóe miệng, hai chân mày…Nhưng lĩnh vực làm giàu cho thẩm mỹ làm giàu cho luật sư 4.2 Kiến nghị Sau hồn thành khóa luận này, tơi nhận thấy C.botulinum vi sinh vật nguy hiểm với tấc nhiễm độc tố botulism Vì thế, C.botulinum độc tố botulism sử dụng làm vũ khí sinh học với sức lan tỏa hủy diệt mạnh hành tinh Thực phẩm nhiễm C.botulinum khó nhận biết cảm quan nhận biết qua biểu lâm sàn Chúng ta phải thực tốt biện pháp kiểm sốt chúng độc tố vi khuẩn mạnh nhiễm tỷ lệ tử vong cao Trang 58 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT Cần tuyên truyền cho người dân hiểu biết nguy hại loại thực phẩm có khả nhiễm khuẩn C.botulinum Quản lý thực đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm tấc khâu chế biến bảo quản thực phẩm Cần có biện pháp xử lý vi phạm vệ sinh an tồn thực phẩm thích hợp nhằm đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng sức khỏe cộng đồng Tìm hiểu nguyên nhân biểu bệnh để xử lý kịp thời tránh hậu đáng tiếc xảy TÀI LIỆU THAM KHẢO  PHẦN TIẾNG VIỆT [1] Bộ môn vi sinh – khoa Y – Đại học Y Dược TP HCM, 1996 Vi khuẩn học [2] TH.S PHẠM MINH NHỰT, 2010 Bài giảng“ Phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm ” [3] TH.S PHẠM MINH NHỰT, 2010 Bài giảng“ Thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm ” [4] Lê Đình Hùng,1998 Đại cương phương pháp kiểm tra vi sinh vật thực phẩm Trung tâm Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng khu vực III, TP HCM Trang 59 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT [5] Lương Đức Phẩm, 2002 Vi sinh vật học an tồn vệ sinh thực phẩm.Nhà xuất Nơng Nghiệp – Hà Nội [6] Trần Linh Thước, 2006 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất Giáo Dục [7] Nguyễn Ngọc Tuân, 2002 Vệ sinh thịt Nhà xuất Nông Nghiệp – TP HCM  PHẦN TIẾNG NƯỚC NGOÀI [8] Clinical Verterinary Microbiologin [9].FAO,1992 Microbiological analysis in the food centrol laboratory 10.P J Quinn cs, 1994 Clirical Verteriaary Microbiology  PHẦN TRANG WEB [11] http:// vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html [12].Clostridium botulinum: ecology and control in foods by Andreas H W Hauschild,Karen L Dodds Trang 60 ... hành thực khóa luận “ Tìm hiểu quy trình phát Clostritridium botulinum thịt” 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu vi sinh vật gây bệnh thịt sâu tìm hiểu quy trình phát C .botulinum độc tố botulin... (familia) : Clostridiaceae - Chi (genus) : Clostridium - Loài (species) : C Botulinum Hình 2.2 Clostridium botulinum 2.2.2 Lịch sử phát Clostridium botulinum lần công nhận cô lập năm 1896 Emile... chua cho vi khuẩn phát triển 2.2.5 Đặc điểm sinh hóa C .botulinum phát triển pH acid thấp 4.5 Nồng độ muối 1% ngăn cản phát triển vi khuẩn C .botulinum sử dụng lactose nguồn cacbon C .botulinum chia