Xây dựng phương pháp phát hiện 6, monoacetylmorphin trong mẫu nước tiểu bằng GC và MS

Một trong những biện pháp hỗ trợ cho công tác phòng ngừa là phát hiện, đánh giá mức độ sử dụng ma túy của các đối tượng sử dụng các chất ma túy [2].. Một số thuốc có sản phẩm chuyển hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN 6-MONOACETYLMORPHIN TRONG MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG GC-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN 6-MONOACETYLMORPHIN TRONG MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG GC-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Xuân Trường

HÀ NỘI 2013

tình yêu khoa học cho mỗi học viên may mắn được thầy hướng dẫn

Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, đặc biệt các thầy cô trong bộ môn kiểm nghiệm thuốc- độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học

Tôi xin được cảm ơn tới các anh chị đồng nghiệp nơi tôi công tác, cùng các anh chị công tác tại Trung tâm Giám định ma túy-Viện Khoa học Hình sự, đặc biệt là Th.s Đỗ Duy Nam, Th.s Hoàng Ngọc Mai đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, chồng, em trai đã động viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt khóa học

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Minh Nguyệt

 

MỤC LỤC

 

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Vài nét về các nhóm ma túy 3

1.1.1 Một số khái niệm về chất ma túy 3

1.1.2.Phân loại các chất ma túy 4

1.2 Các chất ma túy nhóm opiat 5

1.2.1 Lịch sử 5

1.2.2 Cấu trúc, và tác dụng của các chất nhóm opiat [5] 5

1.3 Chất chuyển hóa 6-MAM 11

1.3.1 Cấu tạo, tính chất 6-MAM 11

1.3.2 Các phương pháp phân tích 6-MAM 14

1.4 Kĩ thuật chuẩn bị mẫu 24

1.4.1 Kiểm tra sơ bộ 24

1.4.2 Tách chiết mẫu 25

1.4.3 Dẫn xuất hóa mẫu phân tích 25

1.4.4 Chất nội chuẩn 26

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Hóa chất và thiết bị: 27

2.3 Phương pháp và nội dung nghiên cứu 27

2.3.1 Điều kiện làm việc của hệ sắc ký khí – khối phổ (GC-MS) 27

2.3.2 Khảo sát chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết 28

2.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng 6- MAM trong nước tiểu bằng GC- MS 29

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 33

3.1 Xây dựng quy trình chiết, phân tích 6-MAM trong nước tiểu 33

3.1.1 Lựa chọn điều kiện phân tích 6-MAM trên GC-FID 33

3.1.2 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết 34

3.1.3 Khảo sát lựa chọn pH môi trường chiết xuất 6-MAM trong mẫu nước tiểu 38

3.1.4 Khảo sát sự ổn định 6-MAM trong mẫu nước tiểu 40

3.1.5 Lựa chọn điều kiện dẫn xuất 6-MAM và phân tích trên GC-MS trong mẫu nước tiểu 44

3.1.6 Quy trình phân tích 6-MAM trong mẫu nước tiểu bằng chiết lỏng-lỏng, dẫn xuất hóa và phân tích trên GC-MS 47

3.2 Thẩm định phương pháp định lượng 6-MAM trong nước tiểu bằng GC-MS 49

3.2.1 Khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu 49

3.2.2 Đường chuẩn, khoảng làm việc, Giới hạn phát hiện (LOD) , ngưỡng phát hiện (Cut off) 51

3.2.3 Độ đúng 53

3.2.4 Độ chính xác 54

3.2.5 Độ thu hồi 55

3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực tế 56

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 60

4.1 Về thẩm định phương pháp phân tích 6-MAM trong nước tiểu 60

4.2 Về phân tích mẫu thực tế 60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

 

 

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT/ KÝ HIỆU

liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IS (Internal Standard) Chất nội chuẩn

LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát hiện

LOQ (Limit of Quantification) Giới hạn định lượng

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Morphin 6

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa của các chất nhóm opiat 10

Hình 1.3 Công thức cấu tạo 6-MAM 11

Hình 1.4 Sơ đồ máy khối phổ 21

Hình 1.5 Sơ đồ quá trình ion hóa bằng EI 22

Hình 1.6 Sơ đồ bẫy ion tứ cực 24

Hình 3.1: Phổ đồ của hỗn hợp chất chuẩn methadone, morphine, 6-MAM, Octacosan trong CTSK GC-FID 34

Hình 3.2: Phổ đồ GC của mẫu chiết bằng chloroform trong trường hợp không loại tạp 36

Hình 3.3 : Phổ đồ GC của mẫu chiết bằng chloroform trong trường hợp đã loại tạp 36

Hình 3.4: Biểu đồ biểu thị hiệu suất chiết 6-MAM của các dung môi 37

Hình 3.5: Đồ thị biểu thị khả năng chiết 6-MAM trong nước tiểu ở các giá trị pH 39

Hình 3.6: Phổ đồ GC của mẫu chiết với chloroform ở pH=9 40

Hình 3.7: Phổ đồ GC của mẫu chiết trong ngày đầu 41

Hình 3.8: Phổ đồ GC của mẫu chiết trong ngày thứ 5 42

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ 6-MAM trong thời gian bảo quản 42

Hình 3.10: Sơ đồ phản ứng dẫn xuất 6-MAM + PFPA 44

Hình 3.11: Sự thay đổi hình dạng, chiều cao, thời gian lưu pic khi dẫn xuất: 6-MAM cho pic tại 11,92 phút và 6-MAM-PFP cho pic tại 10,67 phút 46

Hình 3.12: Đồ thị đường chuẩn định lượng 53

Hình 3.13: Phổ đồ kết quả phân tích của mẫu M03 59

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Công thức cấu tạo của các chất nhóm opiat 6

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát dung môi chiết trong trường hợp đã loại tạp 37

Bảng 3.2: Kết quả khả năng chiết 6-MAM trong nước tiểu phụ thuộc vào

pH mẫu 39

Bảng 3.3: Kết quả sự thay đổi tỷ lệ diện tích pic của 6-MAM và chất nội chuẩn trong quá trình bảo quản mẫu nước tiểu 41

Bảng 3.4: Kết quả hiệu suất chiết 6-MAM theo quy trình đã lựa chọn 43

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống 51

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát xây dựng đường chuẩn, xác định LOD, LOQ 52

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát xác định độ đúng 54

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp 56

Bảng 3.9: Một số thông tin ban đầu về mẫu nước tiểu thực tế 57

Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu thực tế 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

 

Ma túy là một vấn nạn, không chỉ trong nội bộ của một quốc gia mà còn là vấn đề cần được quan tâm của nhiều nước Toàn cầu hóa đã mang lại nhiều cơ hội cho sự phát triển kinh tế- xã hội, song cũng đặt ra nhiều thách thức lớn trong công cuộc đấu tranh với tệ nạn ma túy, đặc biệt ở các nước đang phát triển Hiện nay, do mức độ nghiêm trọng từ phương thức đến thủ đoạn sản xuất, vận chuyển, buôn bán ma tuý ngày càng tinh vi đã ảnh hưởng không nhỏ đến công tác quản lý, đấu tranh ngăn chặn ma túy của các nước

Cũng như các quốc gia khác trong khu vực và quốc tế, Việt Nam đã có nhận thức sâu sắc về tác hại của ma túy đối với cá nhân, cộng đồng và xã hội Việc đấu tranh phòng, chống ma túy ở Việt Nam là một mặt trận nóng bỏng, được cả xã hội quan tâm Quốc hội Việt Nam đã thông qua Luật phòng, chống

ma túy năm 2001, Luật sửa đổi, bổ sung một số điều của Luật phòng, chống

ma túy năm 2008 Chính phủ Việt Nam đã tập trung chỉ đạo thực hiện các luật, nghị quyết của Quốc hội, ban hành được nhiều văn bản hướng dẫn thi hành pháp luật về phòng, chống ma túy, cũng như đã thành lập Ủy ban Quốc gia về phòng, chống ma túy

Trong những năm qua, việc phòng, chống ma tuý tại Việt Nam đã đạt được những kết quả quan trọng Tuy vậy, tệ nạn ma túy vẫn diễn biến phức tạp và tiếp tục gây ra các hậu quả nghiêm trọng, ảnh hưởng đến chiến lược phát triển kinh tế, trật tự, an toàn xã hội và phát triển nòi giống Điều này đòi hỏi Việt Nam cần tiếp tục có các giải pháp đồng bộ trong việc đấu tranh ngăn chặn các tệ nạn và tội phạm liên quan đến ma túy Một trong những biện pháp

hỗ trợ cho công tác phòng ngừa là phát hiện, đánh giá mức độ sử dụng ma túy của các đối tượng sử dụng các chất ma túy [2]

Theo thời gian, các đối tượng sử dụng chất ma túy ngày càng đa dạng, tinh vi hơn Điều này thể hiện không chỉ trong việc tàng trữ, sử dụng các chất

ma túy mà còn trong quá trình khai báo khi bị bắt Một số thuốc có sản phẩm chuyển hóa giống sản phẩm chuyển hóa của một số chất ma túy, điều này thường được các đối tượng lợi dụng trong quá trình khai báo nhằm thoát tội

Vì vậy công tác phát hiện các chất ma túy đòi hỏi ngày càng hoàn thiện hơn khắc phục những lỗ hổng mà tội phạm có thể lợi dụng được [2], [9]

Heroin là một trong những chất ma túy nguy hiểm nhất và phổ biến nhất trên thế giới, cũng như ở Việt Nam Heroin được bán tổng hợp từ Morphine Khi vào cơ thể, một trong những sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của heroin được tìm thấy là Morphine, đây cũng là sản phẩm chuyển hóa của một số thuốc chứa hoạt chất codein, morphine, opium Vì vậy khi phát hiện Morphintrong dịch sinh học không thể kết luận đối tượng đã sử dụng Heroin 6-Monoacetylmorphin(6-MAM) là sản phẩm chuyển hóa trung gian của Heroin trong cơ thể, đồng thời cũng là “chìa khóa” để phân biệt Heroin với các opiat khác Tuy nhiên, nồng độ của 6-MAM trong nước tiểu thường rất nhỏ, cần có những thiết bị phân tích hiện đại, có độ nhạy cao để nhận dạng Trên thế giới để xác định việc sử dụng Heroin người ta thường tiến hành phân tích sản phẩm chuyển hóa trung gian 6-MAM Ở Việt Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu toàn diện về vấn đề này [6], [11]

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nhiệm vụ “xây dựng

phương pháp phát hiện 6-Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng GC-MS” với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phát hiện Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí – khối phổ (GC-MS)

6-2 Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu nước tiểu thực tế

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về các nhóm ma túy

1.1.1 Một số khái niệm về chất ma túy

Trong quá trình phát triển, con người đã biết sử dụng một số loại cây cỏ giúp cho tinh thần sảng khoái, chống mệt mỏi Từ thế kỉ thứ 3 trước công nguyên đã có tài liệu ghi nhận việc sử dụng thuốc phiện Thuốc phiện được coi như một loại thần dược chữa bách bệnh Điều đó dẫn tới việc lạm dụng thuốc phiện của loài người Năm 1806, Serturner đã phân lập được một chất tinh khiết đặc trưng cho tác dụng chính của thuốc phiện và gọi tên là Morphine Nó còn được gọi tên là Narcotic, nghĩa là mê mẩn, túy lúy Ở Việt Nam, ban đầu thuật ngữ “ma túy” dùng để chỉ thuốc phiện Tuy nhiên cho tới ngày nay khái niệm đó đã được mở rộng, nó bao gồm thuốc phiện, các sản phẩm thiên nhiên khác như cần sa, cô ca… và hàng loạt các sản phẩm bán tổng hợp, tổng hợp khác Một cách tổng quát nhất, ma túy được định nghĩa:

“các chất ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi trạng thái tâm lý, sinh lý người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra sự phụ thuộc về tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó” [6], [9], [11]

Tại Việt Nam, điều 2 luật phòng chống ma túy được Quốc hội khóa X,

kỳ họp thứ 8 thông qua ngày 9 tháng 12 năm 2000 quy định:

a Chất ma túy là các chất gây nghiện, chất hướng thần được quy định trong các danh mục do Chính phủ ban hành

b Chất gây nghiện là chất kích thích hoặc ức chế thần kinh, dễ gây tình trạng nghiện ðối với ngýời sử dụng

c Chất hýớng thần là chất kích thích, ức chế thần kinh hoặc gây ảo giác, nếu sử dụng nhiều lần có thể dẫn tới tình trạng nghiện ðối với ngýời sử dụng [4]

Theo Nghị định số 82/2013/NĐ-CP của Chính phủ ngày 19 tháng 7 năm 2013 ban hành danh mục các chất ma túy và tiền chất, hiện nay các chất

ma túy gồm 235 chất chia làm 3 danh mục và 41 tiền chất [7]

1.1.2 Phân loại các chất ma túy

Có nhiều cách phân loại các chất ma túy [6], [9], [19]:

 Dựa theo nguồn gốc:

- Ma túy tự nhiên: thuốc phiện, Morphine, Cocain, Cần sa

- Ma túy bán tổng hợp: Heroin ðýợc bán tổng hợp từ Morphine

- Ma túy tổng hợp: Methamphetamin,

 Phân loại theo tác dụng tâm, sinh lý:

- Các chất ức chế thần kinh trung ýõng, có tác dụng giảm ðau, gây ngủ gồm thuốc phiện, các chất Opiat và các chất tác dụng kiểu Morphine

- Các chất kích thích thần kinh trung ýõng nhý Amphetamin, Methamphetamin, các dẫn chất mạch vòng của Amphetamin, Cocainm, cây Khat

- Các chất gây ảo giác nhý Cần sa, LSD, nấm Peyote, Mescalin…

- Các chất an thần, gây ngủ nhý các chất nhóm Benzodiazepin, nhóm Barbiturat

- Một số các chất dung môi bay hõi nhý Ete, Etyl acetat…

 Phân loại theo tính chất hóa học:

- Nhóm alkaloid : Morphine, Codein, Cocain, Heroin

- Nhóm amin thõm: Amphetamin, Methamphetamin…

 Phân loại theo trạng thái vật lý: rắn, lỏng…

Trên thực tế cách phân loại theo tác dụng tâm sinh lý được dùng phổ biến nhất trên thế giới, cách phân loại theo trạng thái vật lý ít được sử dụng vì đa

số các chất ma túy ở trạng thái rắn dưới dạng tinh thể hoặc vô định hình, trừ một số ít chất lỏng như cần sa và các dung môi bay hơi Trong phạm vi đề tài này Heroin và sản phẩm chuyển hóa của nó là đối tượng chính

1.2 Các chất ma túy nhóm opiat

1.2.1 Lịch sử

Thuật ngữ “opiat” được dùng để chỉ những chất có trong thuốc phiện,

là một sản phẩm tự nhiên thu được từ nhựa quả cây thuốc phiện, tên khoa học

là Papaver sonmiferum L, bao gồm morphine, codein, thebain, và các chất bán tổng hợp từ chúng như heroin, oxycodone, hydromorphone

Đầu thế kỷ XIX, lần đầu tiên morphinđược phân lập từ cây thuốc phiện, vào năm 1874 việc tổng hợp diacetylmorphinđược báo cáo Năm 1898, sản phẩm thương mại được ra đời bởi công ty Bayer, người ta đặt tên cho loại thuốc mới này là Heroin Đầu thế kỉ XX, Heroin được chấp nhận rộng rãi như một loại thuốc chuyên dụng, dùng thay thế Codein và Morphintrong điều trị bệnh lao và các bệnh về đường hô hấp khác Cũng trong thời gian này, Heroin lần đầu tiên xuất hiện tại Trung Quốc Vài năm sau, công ước quốc tế về ma túy năm 1925, kiểm soát quốc tế bắt đầu giới hạn việc cung cấp Heroin và cũng từ đây xuất hiện hành vi sản xuất heroin trái phép

Trên thế giới thuốc phiện được phân bố ở bốn khu vực chính là vùng tam giác vàng, lưỡi liềm vàng (chiếm 70% sản lượng trên thế giới), Nam Mỹ,

và phía nam của Bắc- Trung Mỹ Tại Việt Nam, cây thuốc phiện được trồng ở các tỉnh miền núi phía bắc, tuy nhiên việc trồng cây thuốc phiên đã bị cấm, diện tích trồng còn rất ít, chiếm khoảng 400 hecta [2], [6], [9]

1.2.2 Cấu trúc, và tác dụng của các chất nhóm opiat [5]

Trong thuốc phiện có khoảng 40 alkaloid khác nhau, dựa vào cấu trúc

hóa học có thể chia làm 2 nhóm chính: nhóm có chứa nhân Phenanthren (gồm

morphine, codein, thebain…) và nhóm chứa nhâm Benzylisoquinolin (như

narcotin, papaverin…) ngoài ra thuốc phiện còn chứa acid meconic…

1.2.2.1 Cấu trúc hóa học:

 

Cấu tạo phân tử morphin

A: vòng thơm B: vòng cyclohexan C: vòng alcol

D: vòng piperidin E: vòng tetrahydrofuran (cầu nối ete 4,5)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Morphin

Bảng 1.1 Công thức cấu tạo của các chất nhóm opiat

Các nhóm thế ở vị trí số Dẫn chất opiat

ơn, tác dụng giảm đau gây nghiện tăng, ví dụ diacetyl morphin

nhưng thời gian tác dụng lại ngắn như

1.2.2.2 Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng

- Các chất trong nhóm đều có cấu trúc nhân phenan

m rp in, là cấu trúc quyết định tác dụng giảm đau của nhóm

- Các nhóm chức có liên quan đến tác dụng là nhóm –OH phenol ở vị trí 3, nhóm –OH alcol ở vị trí 6, và nhóm thế ở vị trí 17 Khi thay đổi nhóm –

o m rphon, hydro orphon

+ Thay –CH3 ở vị trí 17 của morphin bằng nhóm ally

thì được nalorphin, tác dụng đối kháng vớ

1.2.2.3 Dược động học của nhóm opiat

Hấp thu: các chất opiat có thể đưa vào cơ thể bằng nhiều cách khác nhau, như hút, hít, uống, tiêm, nhai… tùy thuộc vào dạng có sẵn Tuy nhiên,

khi dùng đường uống, các chất này bị chuyển hóa đáng kể bởi chu trình mật, sinh khả dụng thấp 25% đối với morphin, 35% đối với heroin, codein có

gan-ưới dạng hút, hít, tiêm để có tác dụng nhanh chóng, tăng sinh khả

nhau thai, sữa mẹ Tuy nhiên heroin qua hàng rào máu não tốt hơn

ản phẩm thủy phân tách loại acetyl của tạp chất acetylcodein có

sinh khả dụng đường uống cao hơn cả Chúng thường được người nghiện sử dụng d

dụng

Phân bố: khoảng 30% morphin liên kết với protein huyết tương, trong khi heroin chỉ liên kết với protein khi đã được chuyển hóa thành morphin Tập trung nhiều ở cơ vân, gan, phổi, thận Các chất này qua được hàng rào máu não,

morphin

Chuyển hóa và thải trừ: các chất opiat chủ yếu chuyển hóa ở gan Quá trình chuyển hóa bao gồm rất nhiều phản ứng, trong đó phổ biến nhất là các phản ứng thủy phân được nối tiếp bởi các phản ứng liên hợp với acid glucuronic, đồng thời có cả các phản ứng loại nhóm alkyl gắn vào Nitơ Trong quá trình chuyển hóa, heroin nhanh chóng bị thủy phân, loại acetyl tạo 6-monoacetylmorphin, chất này tiếp tục bị loại acetyl, nhưng với tốc độ chậm hơn tạo morphin Phần lớn lượng morphin tạo ra được chuyển hóa dưới dạng liên hợp với acid glucuronic tạo thành 2 dạng sản phẩm, dạng có hoạt tính morphin-6-glucuronic (M-6-G) và dạng không có hoạt tính morphin-3- glucuronic (M-3-G) M-6-G giữ vai trò rất quan trong đối với tác dụng trên hệ thần kinh của morphin Đối với codein, xảy ra quá trình loại acetyl ở C3 tạo morphin, các giai đoạn còn lại giống nhau đối với cả heroin và morphin Bên cạnh đó, codein cũng được tìm thấy trong nước tiểu người sử dụng heroin, tuy nhiên đây là s

trong heroin

Các sản phẩm chuyển hóa được lọc qua cầu thận, sau khi tiêm tĩnh mạch heroin 20-40 giờ, lượng M-3-G trong nước tiểu là 38,2%, morphin tự do

là 4,2%, 6-MAM là 1,3% và heroin tự do là 1,3% Khoảng 90% sản phẩm chuyển hóa được bài tiết vào nước tiểu trong 24 giờ đầu Tuy nhiên, do quá trình chuyển hóa có chu kỳ gan ruột nên có một lượng nhỏ morphin có thể tồn tại trong phân, trong nước tiểu vài ngày thời gian bán thải của morphin

dein, morphin Điều đó chứng tỏ vì sao 6- MAM

c ghi nhận là dấu hiệu đặc hiệu chứng minh cho việc sử dụng heroin ở người nghiện [5], [6], [9]

khoảng 2-3 giờ ở người bình thường Thời gian bán thải (t1/2) của heroin khoảng 5 phút Quá trình này xảy ra tương tự morphin

Dựa vào quá trình chuyển hóa của các chất nhóm opiat, người ta xác định 6- MAM chính là sự khác biệt của heroin so với các nhóm opiat được phép sử dụng trong y học như co

đượ

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa của các chất nhóm opiat

1.3 Chất chuyển hóa 6-MAM

1.3.1 Cấu tạo, tính chất 6-MAM

về sự ổn định của 6-MAM trong nước tiểu

Rop và các cộng sự cho rằng 6-MAM được thủy phân hoàn toàn trong nước trong vòng 7 ngày ở nhiệt độ phòng, và 9% bị thủy phân sau 14 ngày ở nhiệt độ -200C [24]

Poochikian và Cradock thấy rằng hơn 50% 6-MAM bị mất đi sau 9 ngày giữ trong môi trường pH 8.6 ở nhiệt độ phòng [23]

Paul và các cộng sự cho hay 44% 6-MAM bị mất sau 2 tuần trong nước tiểu (pH=6,8), trong khi Barrett và các cộng sự phát hiện 6- MAM không bị thủy phân ở pH 4,0- 7,4 trong cùng điều kiện [22]

Fuller và Anderson nhận thấy rằng cần 12 tuần để thủy phân hoàn toàn 6- MAM trong nước tiểu thành morphintrong điều kiện pH 8,0 tại nhiệt độ phòng Tỷ lệ thủy phân của 6- MAM biến thiên trong khoảng rộng là do sự khác biệt về lực ion của mỗi hệ đệm sử dụng trong mỗi nghiên cứu khác nhau [16]

- Tình hình nghiên cứu 6-MAM trên thế giới

Trên thế giới, định lượng 6-MAM trong nước tiểu được thực hiện từ khá lâu Năm 1989, B.D.Paul và các cộng sự đã tiến hành định lượng 6-MAM trong nước tiểu bằng phương pháp GC-MS Năm 1992, P.P Rop và các cộng

sự thực hiện phát hiện 6-MAM trong huyết tương, máu, nước tiểu bằng

phương pháp HPLC Tuy nhiên về cơ bản phương pháp GC-MS vẫn được sử

đó LOD và LOQ của 6-MAM là 2,0µg/L Tuy nhiên hai tác giả cũng kết luận rằng AC được tìm thấy ở ít mẫu và nồng độ ít hơn 6-MAM Vì vậy, nghiên cứu năm 1998 của 2 tác giả chỉ ra AC không phải là dấu hiệu đáng tin cậy để kết luận đối tượng sử dụng heroin [20]

Năm 2006, hai tác giả Sue Paterson và Rosa Cordero có nghiên cứu so sánh giữa chất chuyển hóa của tạp chất heroin và 6-MAM trong việc sử dụng làm dấu hiệu phát hiện đối tượng sử dụng heroin Nghiên cứu này chỉ ra phân tích chất chuyển hóa của papaverine nhạy cảm hơn 6-MAM, lượng mẫu tìm thấy chất chuyển hóa của papaverine cao hơn 6-MAM rất nhiều lần Nhưng, cũng bởi papaverine là một tạp chất của heroin, thay đổi lượng theo nguồn gốc, cách sản xuất heroin nên sự vắng mặt chất chuyển hóa papaverine trong mẫu không đủ để kết luận đối tượng không sử dụng heroin [21]

Cho tới nay, 6-MAM vẫn là dấu hiệu duy nhất chứng minh việc sử dụng heroin của các đối tượng Ở Việt Nam, heroin chủ yếu là loại heroin Đông Nam Á có hàm hượng diacetylmorphincao, các tạp chất liên quan rất ít

Do vậy việc phát hiện Heroin thông qua phân tích 6-MAM càng trở lên đặc hiệu [9], [11]

- Tình hình nghiên cứu trong nước

  Khóa luận tốt nghiệp Đại học Dược năm 2009, tác giả Bạch Thị Thắm có xây dựng phương pháp phân tích Heroin, Cocain và các sản phẩm trung gian trong nước tiểu trong đó có 6-MAM bằng GC-MS Khóa luận có phạm vi nghiên cứu rộng, 6-MAM là một trong số nhiều đối tượng nghiên cứu của khóa luận Cũng như một số công trình nghiên cứu khác, cho đến nay ở trong nước chưa có công trình nghiên cứu nào xây dựng và thấm định phương pháp giám định 6-MAM trong mẫu nước tiểu một cách toàn diện [8]

1.3.2 Các phương pháp phân tích 6-MAM

1.3.2.1 Phân tích miễn dịch

Phân tích miễn dịch là phương pháp được khuyến khích sử dụng để

phát hiện sơ bộ Phương pháp này dựa vào độ hoạt động phóng xạ (RIA), hoạt tính men (EIA), độ phân cực huỳnh quang…hạn chế của phương pháp này là tính kháng chéo của các kháng thể sử dụng trong các phương pháp phân tích miễn dịch Trong quá trình phân tích có thể gây ra các kết quả dương tính giả của một số loại thuốc giảm đau, chất tương tự, hay chất đối kháng của

morphincó độ kháng chéo cao [27], [28]

1.3.2.2 Phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Hòa tan cặn chiết sau khi đã cô đuổi dung môi vào một lượng nhỏ methanol và tiến hành sắc ký bản mỏng theo các điều kiện sau:

Bản mỏng: bảo mỏng Silica gel G đã được hoạt hóa, độ dày lớp chất

hấp thụ 0,25 mm Nếu có điều kiện sử dụng bản mỏng có thêm chất phát quang ở đèn tử ngoại 254mm

Hệ dung môi triển khai:có thể sử dụng các hệ dung môi sau, trong đó

hệ A,B,C,D thường hay được sử dung hơn:

Hệ A: Toluene/ Aceton/ Ethanol/ NH4OH đặc theo tỷ lệ thể tích tương ứng: 45/45/7/3

Hệ B: Ethylacetat/Methanol/NH4OH: 85/10/5

Hệ C: Methanol/NH4OH : 100/1,5

Hệ D: Chloroform/Methanol : 90/10

Hệ E: Ethanol/ Isopropanol/ Xylen/ Chloroform : 12,5/12,5/25/50

Hệ F: Toluen/ Dioxan/ Ethanol/NH4OH: 50/40/5/5

vv…

Chất chuẩn: 6-MAM

Phát hiện:

Thuốc thử Dragendroff: cho các vết da cam trên nền vàng

Thuốc thử Iodoplatinate: cho các vết màu xanh tím [12], [13] Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm cho vết phát quang

 Ưu điểm của phương pháp phân tích bằng TLC:

Thiết bị sử dụng đơn giản, rẻ tiền, nhanh

Phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động

Có thể thực hiện tách các mẫu có nhiều thành phần: Có thể thực hiện sắc ký đồng thời 10-20 mẫu hoặc hơn

 Nhược điểm: Độ lặp lại thấp do thành phần pha động thay đổi trong quá trình khai triển sắc ký khí Tăng độ giãn rộng pic Độ nhạy kém hơn các phương pháp khác [27], [28]

1.3.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Cặn chiết nước tiểu hòa tan vào một lượng nhỏ acetonitrile hoặc dung môi pha động và tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng cao đồng thời với chất chuẩn theo các điều kiện sau

Phương pháp 1:

Cột tách: Octadecylsilica Hypersil, chiều dài 100mm, đường kính trong 2,1mm, đường kính hạt 3 µm

Pha động: A: dung dịch đệm phosphat 10mM (pH 6,8)

Detector: photodiod array detector (bước sóng 218 nm)

Thời gian lưu của 6-MAM là 24,5 phút

Dung dịch A: hỗn hợp NH4OH/ Methanol tỷ lệ ½

Dung dịch B: Hỗn hợp acid acetic băng/ Methanol tỷ lệ 1/1

Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút

Detector: 218 nm

Phương pháp này có một số những hạn chế như: cần dùng nhiều dung môi, hóa chất có độ tinh khiết cao nên bất lợi về kinh tế, thời gian phân tích dài [12], [13]

- Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột

- Detector: Phát hiện chất phân tích trong mẫu

- Hệ thống thu nhận và xử lý số liệu

- Hệ cấp pha động

Trong sắc ký khí pha động thường là khí trơ như: heli, argon, nitơ hoặc khí carbonic và khí hydro Lựa chọn khí trơ nào phụ thuộc vào detector cần dùng Nhiệm vụ của pha động là đưa chất tan qua cột, vì vậy người ta gọi pha động là khí mang Đi kèm với bình cấp khí mang có van giảm áp, đồng hồ kiểm tra lưu lượng khí

Áp suất vào cột dao động trong khoảng 10-50 psi, đảm bảo tốc độ dòng 1÷50ml tùy vào loại cột

Với detector MS, khí trơ hay dùng nhất là heli Heli thường cho pic hẹp hơn (do chuyển khối nhanh hơn) Các khí cần phải thật tinh khiết, thường cho qua các chất hấp phụ thích hợp (bẫy tạp) để loại hơi nước và các tạp chất

- Hệ tiêm mẫu

Mẫu phân tích được tiêm nhanh vào dòng pha động với một lượng vừa

đủ bằng bơm tiêm nhỏ hoặc van tiêm mẫu Nếu tiêm mẫu dư thì pic sắc ký giãn rộng, độ phân giải kém Thể tích mẫu chất lỏng hay dung dịch khoảng 0,1-10 µL được đưa qua cổng tiêm ở đầu cột Cổng mẫu thường có nhiệt độ cao hơn 500C so với điểm sôi cao nhất của thành phần trong mẫu Nếu mẫu phân tích là khí dùng van tiêm mẫu khí hoặc bơm tiêm khí Có nhiều kỹ thuật tiêm mẫu: chia dòng, không chia dòng, bay hơi nhanh, thẳng vào cột Ngoài

ra còn có hệ bơm mẫu tự động, kỹ thuật này giúp xử lý được nhiều mẫu, và làm tăng độ chính xác thể tích tiêm

- Cột và lò cột

Cùng với detector, hệ thống cột tách là bộ phận quan trọng nhất của sắc

ký khí Chất cần phân tích được tiêm vào buồng bơm mẫu và hóa hơi bởi nhiệt độ Nhờ hệ thống khí mang, mẫu được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Qúa trình tách sắc ký xảy ra tại đây Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện, khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi Trong sắc ký khí có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản Hiện nay, do có nhiều ưu điểm nên cột mao quan được sử dụng phổ biến hơn

 Ưu điểm cột mao quản so với cột nhồi:

- Các hỗn hợp phức tạp được tách với hiệu suất cao hơn hẳn

- Tách được cả các chất có cấu trúc hóa học gần nhau

- Độ tin cậy cao hơn trong việc nhận biết các cấu tử

- Độ nhạy phát hiện lớn

- Giảm thời gian phân tích

- Cho phép ghép nối trục tiếp với khối phổ kể mà không cần

bộ tách

d Pha tĩnh

Có hai loại pha tĩnh thông dụng:

- Loại thứ nhất ít hoặc không phân cực, cấu tạo bởi polyme của siloxan như OV1, DB1, HP1, SPB1, Rtx1 (100% methyl-polysiloxan)

- Loại thứ hai phân cực, cấu tạo bởi polyethylene glycon như Carbowax 20M, Superox, DB – wax

e Detector

Phát hiện chất phân tích ở dạng khí trong dòng pha động khi đến detector dựa trên sự thay đổi tính chất vật lý hoặc tính chất riêng biệt nào đó khi rửa giải có thể phân detector ra làm hai nhóm:

- Detector vạn năng đáp ứng với tất cả các chất tan

- Detector chọn lọc đáp ứng với đặc tính riêng biệt nào đó của chất tan

Hiện nay có nhiều loại detector đã được nghiên cứu Có 4 loại được sử dụng phổ biến nhất là:

- Detector dẫn nhiệt TCD

- Detector ion hóa ngọn lửa FID

- Detector nitơ phosphor NPD

- Detector cộng kết điện tử ECD

Ngoài ra còn một loại detector đặc biệt ngoài vai trò phát hiện khối phổ còn có khả năng tách các chất đồng rửa giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng của chúng Đó là detector khối phổ MS

Detector khối phổ trong sắc ký khí

Khối phổ (mass spectrometry) là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tôc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lượng các chất

Cấu tạo máy khối phổ

Cấu tạo máy khối phổ được mô tả như sơ đồ Bao gồm 5 bộ phận sau

Bộ nạp mẫu: Đưa mẫu vào máy Trong cấu tạo máy sắc ký khí – khối

phổ, mẫu được đưa vào từ sắc ký khí thông qua bộ phận Transfer line đi đến máy khối phổ

Bộ nguồn ion: Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí

hoặc hơi

Bộ phân tích khối: Tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và

tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector

Detector: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo

bằng hệ điện tử của máy khối phổ

Bộ xử lý dữ liệu: Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi

chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ,

Bộ nguồn ion (ion sources)

Có nhiều cách để ion hóa

phân tử hoặc nguyên tử của

mẫu, trong đó phổ biến nhất

là kĩ thuật ion hóa bằng va

chạm electron (Electron

Impact - EI)

Hình 1.4 Sơ đồ máy khối phổ

Trong buồng ion hóa các electron phát ra từ một catod vonfram hoặc reni khi đốt nóng Chùm tia electron này bay về anod với vận tốc lớn (có năng lượng khoảng 70eV) va chạm với phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Một

electron tấn công một phân tử với năng lượng dư lớn sẽ loại một electron khác khỏi phân tử này Qúa trình này hầu như chỉ tạo ra các ion dương Sau

đó các ion này sẽ bị bẻ gãy thành các mảnh ion có khối lượng nhỏ hơn Các

ion này được thu lại và dẫn vào trong bộ phân tích khối

Hình 1.5 Sơ đồ quá trình ion hóa bằng EI

Bộ phân tích khối (Mass analyser)

Bộ phân tích khối là bộ phận quan trọng nhất, có nhiệm vụ tách các ion

có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt Có thể phân thành 4 loại là

tứ cực, thiết bị từ, phân tích thời gian bay, phân tích cộng hưởng ion cyclotron Nhưng thông dụng nhất là thiết bị tứ cực hoặc bẫy ion tứ cực là thông dụng nhất

Bộ tứ cực đơn: Bộ phân tích này có 4 cực kim loại đặt song song và sát

nhau Có một khoảng không giữa 4 cực đó để cho các ion bay qua Có điện thế một chiều và tín hiệu xoay chiều cao tần áo vào các cặp đối diện của bốn cực Các ion bay qua khoảng không giữa 4 cực được gia tốc bởi điện thế một chiều và tín hiệu xoay chiều Thiết kế này sẽ tạo cho một số ion có tỷ số m/z xác định có thể đi thẳng qua khoảng không đến detector Đó là các ion cộng hưởng Trong khi đó tất cả các ion khác không cộng hưởng với thế xoay chiều xác định sẽ có quỹ đạo không ổn định, va chạm với các cực và bị giữ lại ở đó

Bẫy ion tứ cực: bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý của bộ phân

tích khối tứ cực: chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy

Bộ phận phát hiện (detector)

Thường có hai loại là nhân electron và nhân quang:

Nhân electron: Tác động của một ion lên bề mặt của các bán dẫn sẽ tạo

ra electron Nó được tăng tốc, va chạm tiếp với bề mặt của các bán dẫn khác

để tạo ra các electron khác Quá trình cứ thế tiếp diễn để tạo ra nhiều electron Các electron được thu nhận và số lượng của chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu

Nhân quang: Các electron tạo ra theo cách trên va chạm với một bề mặt

phát quang để tạo ra photon Các photon này được thu nhận và số lượng của

chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu

Trong giám định các chất ma túy, sắc ký khí là phương pháp phổ biến hơn cả vì những ưu điểm như:

+ Hầu hết các chất ma túy là các chất có khả năng hóa hơi dưới tác dụng của nhiệt và chúng ít bị phân hủy bởi nhiệt

+ GC là phương pháp tách các cấu tử cho độ phân giải cao

+ Sử dụng GC phân tích mẫu rất kinh tế vì tốn ít dung môi, hóa chất + GC cho độ lặp lại của chỉ số thời gian lưu và diện tích pic cao

+ Gc sử dụng lượng mẫu rất ít

+ Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng nhỏ

+ Việc sử dụng và bảo dưỡng GC không phức tạp

So với HPLC, GC có thời gian phân tích nhanh hơn và hiện nay vẫn là một trong những phương pháp hóa lý hiện đại nhất, được ứng dụng nhiều nhất trong giám định các chất ma túy Hiện nay các hệ thống ghép nối GC với detector MS cho phép định tính các chất không chỉ bằng thời gian lưu mà còn bởi phổ phân tích cấu trúc tương ứng [9], [18], [19]

Hình 1.6 Sơ đồ bẫy ion tứ cực

1.4 Kĩ thuật chuẩn bị mẫu

1.4.1 Kiểm tra sơ bộ

Mẫu phân tích thu được bao giờ cũng được kiểm tra sơ bộ như quan sát về màu sắc, mùi, tỷ trọng, pH, độ pha loãng, sau đó tiến hành xử lý mẫu Đối với mẫu nước tiểu dùng để phân tích 6-MAM việc thủy phân mẫu được

bỏ qua vì quá trình này làm biến đổi 6-MAM thành morphine, việc phát hiện 6-MAM sẽ không còn ý nghĩa [6], [9]

1.4.2 Tách chiết mẫu

Đây là giai đoạn quan trọng, do các mẫu phẩm sinh học là một hỗn hợp rất phức tạp bao gồm rất nhiều chất vô cơ, hữu cơ có khối lượng lớn trong khi lượng chất cần phân tích rất nhỏ Quá trình chiết xuất thường tiến hành theo phương pháp chiết lỏng-lỏng, sử dụng các dung môi hữu cơ trong các môi trường có pH khác nhau Chiết lỏng – lỏng là sự tách các chất dựa trên cơ sở hòa tan hay phân bố của chất trong hai dung môi không trộn lẫn vào nhau [6], [9], [12]

Các điều kiện để chiết mẫu:

Với 6-MAM, do có nhóm Nitơ bậc 3 (alcaloid), vì vậy khi chiết cần điều chỉnh pH nước tiểu trong khoảng pH kiềm Các dung môi hữu cơ dùng trong chiết xuất là các dung môi thông dụng trong phòng thí nghiệm hóa học như là Chloroform, Dichloromethane, Ethyl acetate,

Quá trình chiết mẫu cho ra đồng thời 6-MAM và morphine

1.4.3 Dẫn xuất hóa mẫu phân tích

1.4.3.1 Silyl hóa

Để tăng độ nhạy và tăng hiệu quả phân tích sắc ký khí các chất opiat và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong nước tiểu, cặn chiết thu được sau khi cô đuổi dung môi thường được dẫn xuất hóa với một lượng nhỏ (20µl) N,O-bis-trimethyisilyifluoroacetamide (BSTFA) hoặc N,O-bis-trimethylsilylacetamit (BSA) trong một bình kín ở nhiệt độ 850C trong 15 phút Cũng có thể kết hợp tác nhân silyl hóa với pyridine theo tỷ lệ 1:1, bơm trực tiếp không cần xử lý nhiệt

Nếu sử dụng detector NPD thì có thể tiến hành silyl hóa với các tác nhân bay hơi như N-methyl-N- trimethyisilyifluoroacetamide (MSTFA) hoặc

một hỗn hợp gồm hexa-methyldisilasane (HMDS), trimethylchlorosilane (TMCS), và pyridine Hỗn hợp dẫn xuất hóa có thể cô khô sau đó hòa tan vào các dung môi khô như toluene ngay trước khi bơm vào cột sắc ký khí

Các dẫn xuất silyl có bản chất không bền vững nên chỉ tiến hành dẫn xuất hóa ngay trước khi bơm vào cột sắc ký khí [7], [27], [28]

1.4.3.2 Acyl hóa

Cách 1: thêm 50µl Ether dầu hỏa pentafluoropropionic (PFPA) vào cặn chiết nước tiểu, đậy kín và xử lý ở 650C trong 30 phút Cô bay hơi lượng PFPA thừa Sau đó hòa lại vào 50 µl ethylacetat và tiến hành bơm mẫu Dẫn xuất hóa của PFPA có thể bền vững trong PFPA hàng tháng Sau khi cô đuổi PFPA có thể bảo quản được 24 giờ Cách này thường được sử dụng trong phân tích 6-MAM bằng GC-MS

Cách 2: thêm Ether dầu hỏa trifluoroaxetic vào cặn chiết nước tiểu, đậy kín và xử lý ở 550C trong 30 phút Cô bay hơi, sau đó hòa lại vào 50µl ethylacetat và tiến hành bơm mẫu [7], [27], [28]

1.4.4 Chất nội chuẩn

Để đảm bảo độ tin cậy của phân tích định tính, định lượng trong các phương pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), khối phổ (MS), cần thiết phải sử dụng các chất nội chuẩn, các chất này được thêm vào mẫu trước khi phân tích, tùy theo mục đích Các chất nội chuẩn dùng trong phân tích opiate là Nalorphine (GC), các đồng vị nặng của morphinvà các dẫn chất (GC-MS) Nếu không có các chất nội chuẩn này có thể thay thế bằng các n-ankan có thời gian lưu trên sắc kí gần với các chất cần phân tích [7], [27], [28]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 6-MAM trong mẫu nước tiểu người nghiện Các mẫu nước tiểu người nghiện được gửi tới giám định tại trung tâm giám định

ma túy- Viện Khoa học hình sự

2.2 Hóa chất và thiết bị:

Các hóa chất:

Chuẩn 6-MAM (6-Acetylmorphin.HCl 99.087%) Lot No: 43.1B5.1 của Lipomed AG, CH4144 Arlesheim, Switzerland

Chất nội chuẩn octacosan ≥ 99% (Aldrich)

Các dung môi, hóa chất của Merck, đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

Thiết bị: GC-MS Thermo-Finnigant TraceGC Ultra - DSQ với

Autosampler AS3000 (Mỹ)

Cân phân tích

Máy lắc

Máy cất thu hồi dung môi

Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, ống nghiệm và các dụng cụ

phòng thí nghiệm khác

2.3 Phương pháp và nội dung nghiên cứu

2.3.1 Điều kiện làm việc của hệ sắc ký khí – khối phổ (GC-MS)

  Khảo sát lựa chọn các điều kiện làm việc tối ưu của thiết bị trên các mẫu chất chuẩn để đưa ra chương trình sắc ký phù hợp: Cột sắc ký, khí mang, chương trình nhiệt độ, kĩ thuật tiêm mẫu, thể tích tiêm mẫu

2.3.2 Khảo sát chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết

Khảo sát chọn dung môi chiết

Để tìm được dung môi chiết tối ưu, ta cố định ba thông số pH chiết, thể tích dung môi, nồng độ các cấu tử 6-MAM để khảo sát dung môi cho hiệu suất cao nhất

Đưa ra các tiêu chí để lựa chọn 1 số dung môi Sau đó, qua một số tài liệu chuyên ngành, thu được tiến hành khảo sát, so sánh để tìm loại dung môi phù hợp nhất

Khảo sát hiệu suất chiết 6- MAM phụ thuộc vào pH mẫu

6-MAM có chứa nitơ bậc 3 vì vậy mang tính kiềm yếu, khảo sát hiệu suất chiết 6-MAM trong môi trường kiềm, với dãy pH 7,8,9,10,11 bằng các

hệ đệm

Khảo sát độ ổn định của 6-MAM trong mẫu nước tiểu

Thêm 6-MAM vào mẫu nước tiểu trắng và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong phòng thí nghiệm Sau mỗi ngày lấy 15ml chia làm 3 mẫu đem chiết, phân tích 6-MAM trong điều kiện đã lựa chọn trong vòng 5 ngày

Khảo sát hiệu suất chiết

Thêm 6-MAM chuẩn vào nước tiểu trắng sau đó thực hiện việc chiết suất (Chiết 3 lần dung môi) Đo mẫu chiết xuất và mẫu nước tiểu trắng có 6-MAM

ở cùng nồng độ So sánh tỉ lệ diện tích Pic, ta thu được hiệu suất chiết

Khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu dẫn xuất

Khảo sát việc dẫn xuất hóa 6-MAM ở các nhiệt độ 50, 60 70, 80oC trong thời gian 10, 20, 30 phút Mỗi điểm nhiệt độ và thời gian xác định tiến hành song song 3 mẫu Từ đó xác định điều kiện dẫn xuất tối ưu

2.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng 6- MAM trong nước tiểu bằng GC- MS

Để đảm bảo phương pháp phân tích định lượng đã xây dựng đạt yêu cầu ứng dụng phân tích thực tế thì phương pháp đó cần phải được thẩm định với những tiêu chí như: độ đúng, độ chính xác, tính chọn lọc, giới hạn định lượng, khoảng nồng độ tuyến tính, độ thu hồi [10], [29]

2.3.3.2 Tính chọn lọc, đặc hiệu

Tính chọn lọc nói lên khả năng xác định đúng chất phân tích khi có mặt

các tạp chất hoặc chất khác Xác định tính chọn lọc bằng cách phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm chất chuẩn

Trong sắc ký khí khối phổ có thể xác định tính chọn lọc, đặc hiệu thông qua thư viện phổ chuẩn của 6-MAM Dựa vào các mảnh phổ có thể xác định

sự có mặt của 6-MAM

2.3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện LOD (limit of detection) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể Trong sắc ký khí LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N=3)