Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 60 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
60
Dung lượng
1,52 MB
Nội dung
BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐOÀN THỊ THẢO XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM DEOXYNIVALENOL VÀ ZEARALENONE TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC PHẨM BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐOÀN THỊ THẢO XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM DEOXYNIVALENOL VÀ ZEARALENONE TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC PHẨM BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. ThS. Trần Cao Sơn 2. ThS. Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: Viện Kiểm ngiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn của mình tới những ngƣời đã nhiệt tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Trƣớc hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Trần Cao Sơn, ngƣời đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Đặng Ngọc Lan đã định hƣớng cho tôi trong quá trình tìm tài liệu cũng nhƣ hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (NIFC) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đề tôi hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, các phòng ban, cùng các giảng viên, nhân viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất và các bộ môn khác trong Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Đoàn Thị Thảo MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về độc tố deoxynivalenol và zearalenone 2 1.1.1. Deoxynivalenol (DON) 2 1.1.2. Zearalenone (ZEA) 3 1.1.3. Giới hạn ô nhiễm DON và ZEA trong thực phẩm [2] 5 1.2. Hàm lƣợng độc tố vi nấm DON và ZEA trong thực phẩm 6 1.3. Tổng quan phƣơng pháp xác định DON và ZEA 9 1.3.1. Các phương pháp đã được thực hiện 9 1.3.2. Phương pháp QuEChERS 11 1.3.3. Phương pháp LC-MS/MS 12 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 17 2.1.3. Dung môi, hóa chất 18 2.1.4. Chất chuẩn 18 2.1.5. Pha dung dịch chuẩn 19 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 2.2.1. Khảo sát các điều kiện xác định độc tố vi nấm bằng LC-MS/MS 20 2.2.2 . Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 20 2.2.3. Thẩm định phương pháp 20 2.2.4. Ứng dụng phương pháp 20 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS 20 2.3.2. Phương pháp thẩm định 21 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu 23 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Tối ƣu hóa điều kiện tách và xác định mycotoxin trên thiết bị LC-MS/MS 24 3.1.1. Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ 24 3.1.2. Lựa chọn các điều kiện sắc kí lỏng 25 3.2. Lựa chọn các điều kiện xử lý mẫu 27 3.2.1. Khảo sát dung môi chiết 27 3.2.2. Khảo sát bước làm sạch 29 3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 31 3.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc 31 3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 33 3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 34 3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi 36 3.4. Kết quả xác định ZEA và DON trong một số mẫu thực phẩm ngô 39 IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt AA Acid acetic ACN Acetonitrile AOAC Association of Official Analytical Community Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức AF Acid formic APCI Atmospheric pressure chemical ionization Chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên DON Deoxynivalenol d-SPE Dispersive Solid Phase Extraction Chiết phân tán pha rắn ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng ML Maximum Limit Giới hạn dƣ lƣợng tối đa MS Mass spectrometry Khối phổ PSA Primary Secondary Amine Chất hấp phụ amin bậc 1, bậc 2 R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn ZEA Zearalenone DANH MỤC BẢNG STT Bảng Nội dung Trang 1 Bảng 1.1. Giới hạn cho phép deoxynivalenol trong thực phẩm 5 2 Bảng 1.2. Giới hạn cho phép zearalenone trong thực phẩm 6 3 Bảng 1.3. Hàm lƣợng DON (µg/kg) trong thực phẩm ở EU 7 4 Bảng 1.4. Hàm lƣợng ZEA (µg/kg) trong thực phẩm ở châu Âu 7 5 Bảng 1.5. Ô nhiễm ZEA trong ngô ở Argentina từ 1999-2010 8 6 Bảng 1.6. Ô nhiễm DON trong ngô tại Argentina từ 1999-2010 8 7 Bảng 1.7. Ô nhiễm DON trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia năm 2010 9 8 Bảng 1.8 Ô nhiễm ZEA trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia năm 2005 9 9 Bảng 1.9. Tóm tắt một số phƣơng pháp tiêu chuẩn xác định độc tố vi nấm ZEA và DON trong ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc 10 10 Bảng 1.10. Các phƣơng pháp phân tích đồng thời ZEA và DON đã thực hiện 10 11 Bảng 1.11. Xác định độc tố vi nấm bằng phƣơng pháp QuEChERS 12 12 Bảng 2.1. Các độc tố vi nấm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 17 13 Bảng 2.2. Pha các dung dịch chuẩn xây dựng đƣờng chuẩn 19 14 Bảng 3.1. Các điều kiện phân tích độc tố vi nấm bằng ESI(-)-MS/MS 24 15 Bảng 3.2. Các thông số tối ƣu của MS đối vớ 25 16 Bảng 3.3. Chƣơng trình gradient phân tích ZEA và DON 26 17 Bảng 3.4. So sánh các loại dung môi chiết đến độ thu hồi của ZEA và DON 28 18 Bảng 3.5. Khảo sát ảnh hƣởng của việc sử dụng PSA và C18 đến độ thu hồi của ZEA và DON 29 19 Bảng 3.6. LOD và LOQ của ZEA và DON 33 20 Bảng 3.7. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của ZEA và DON 34 21 Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của DON trên nền mẫu ngô 36 22 Bảng 3.9. Độ lặp lại và độ thu hồi của ZEA trên nền mẫu ngô 37 23 Bảng 3.10 Kết quả xác định hàm lƣợng các độc tố vi nấm trong một số sản phẩm từ ngô tại Hà Nội tháng 5 - 2015 40 DANH MỤC HÌNH VẼ TT Hình Nội dung Trang 1 Hình 1.1. Công thức cấu tạo của deoxynivalenol 3 2 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Zearalenone 4 3 Hình 1.3. Tình trạng nhiễm độc tố vi nấm do Fusarium tại 11 nƣớc 6 4 Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS/MS 14 5 Hình 3.1. Sắc kí đồ chuẩn hỗn hợp ZEA – DON phân tích bằng chƣơng trình gradient 3 27 6 Hình 3.2. Sắc ký đồ ZEA và DON khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau 28 7 Hình 3.3. Sắc ký đồ ZEA khi sử dụng chất hấp phụ PSA, C 18 30 8 Hình 3.4. Quy trình xử lý mẫu phân tích đồng thời ZEA và DON 31 9 Hình 3.5. Sắc ký đồ ZEA và DON ở mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn 32 10 Hình 3.6. Sắc đồ ZEA tại LOQ 2 ng/ml (tƣơng đƣơng 10 µg/kg trên mẫu) 33 11 Hình 3.7. Sắc đồ DON tại LOQ 20 ng/ml (tƣơng đƣơng 100 µg/kg trên mẫu) 34 12 Hình 3.8. Đƣờng chuẩn ZEA 34 13 Hình 3.9. Đƣờng chuẩn DON 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề báo động với toàn thể xã hội. Số lƣợng cũng nhƣ mức độ nguy hiểm của các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng, trong đó độc tố vi nấm là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc nhƣng lại ít đƣợc đề cập đến. Độc tố vi nấm đƣợc sinh ra do nhiều loài nấm mốc khác nhau, chúng đƣợc phát hiện trên nhiều loại lƣơng thực, thực phẩm khác nhau. Hiện nay, có đến hơn 400 loại độc tố vi nấm đã đƣợc xác định. Trong đó, các loại độc tố vi nấm chính đƣợc quan tâm nhất bao gồm các aflatoxin, ochratoxin, fumonisin, deoxynivalenol, zearalenone… Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu xác định các độc tố vi nấm aflatoxin B1, B2, G1, G2, ochratoxin A… Tuy nhiên, chƣa có nhiều nghiên cứu về phƣơng pháp xác định các độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone trong thực phẩm, hơn nữa các phƣơng pháp phân tích thông thƣờng chỉ hƣớng đến phân tích riêng lẻ các độc tố mà chƣa xác định đồng thời đƣợc chúng. Với lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Xác định đồng thời độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone trong một số sản phẩm thực phẩm bằng LC-MS/MS”. Thực hiện khóa luận này chúng tôi nhằm tới 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định đồng thời deoxynivalenol và zearalenone bằng LC-MS/MS. 2. Áp dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng deoxynivalenol và zearalenone cho một số sản phẩm trên thị trƣờng. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone Độc tố vi nấm là chất chuyển hóa thứ cấp độc hại đƣợc sinh ra bởi các loài nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium và Alternaria [38]. Độc tố vi nấm có thể đƣợc định nghĩa là “chất chuyển hóa của nấm mốc mà khi ăn phải, hít vào hoặc hấp thu qua da gây ra bệnh tật hoặc gây tử vong cho ngƣời và động vật” [26] . Độc tố vi nấm gây ra một loạt các tác dụng độc hại. Chúng là những chất gây ung thƣ, độc với thần kinh, gây quái thai và gây suy giảm miễn dịch [22] [25]. Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây nhƣ thối rễ, thân, bắp, củ… một số loài còn sinh ra độc tố nấm lẫn tạp trong ngũ cốc. Một số chất độc gây tác hại đến sức khỏe con ngƣời có thể kể đến nhƣ độc tố T-2 toxin, fumonisin, zearalenone, deoxynivalenol… dƣới đây sẽ đề cập đến 2 loại độc tố hay gặp trong ngũ cốc, cây trồng tại Việt Nam: zearalenone, deoxynivalenol. 1.1.1. Deoxynivalenol (DON) 1.1.1.1. Cấu trúc, tính chất hóa lý DON là một loại độc tố vi nấm thuộc nhóm trichothecen. Đây là một nhóm các hợp chất có cấu trúc liên quan đến một hệ thống vòng tetracyclic sesquiterpenoid. Khoảng 170 trichothecen đã đƣợc xác định [16] [15] và đƣợc chia thành bốn loại (A-D) dựa trên sự thay đổi nhóm chức hydroxyl và nhóm bên acetoxy. Loại A, đại diện là HT-2 và T-2 toxin, loại B thƣờng gặp là deoxynivalenol (DON), loại C và D thƣờng ít gặp hơn [21]. DON hay còn gọi là vomitoxin đƣợc sinh ra bởi các loài F. graminearum, F. culmorum và F. cerealis [21]. DON có thể đƣợc sinh ra ở nhiệt độ từ 21-29 o C và độ ẩm trên 20%. DON dễ tan trong một số dung môi phân cực nhƣ methanol, ethanol và acetonitril. DON là chất rất bền nhiệt và bền với môi trƣờng acid, không bị ảnh hƣởng của quá trình chế biến [29]. [...]... DON v ZEA trong ú nh TLC, ELISA, GC vi k thut ECD hoc MS , LC UV hoc FLD, v LC- MS Cỏc phng phỏp ny tp trung vo xỏc nh tng loi c t vi nm hoc nhúm c t riờng bit, do ú cú nhiu u im v tớnh c hiu 10 Bng 1.9 Túm tt mt s phng phỏp tiờu chun xỏc nh c t vi nm ZEA v DON trong ng cc v sn phm t ng cc c t vi nm Zearalenone Deoxynivalenol Phng phỏp tiờu Lm nh chun Loi nn mu sch lng IAC HPLC-Fl IAC HPLC-UV Ngụ,... MS/ MS 75117% 2,3-146 àg/kg 26 c t vi nm d-SPE (MgSO4+C18) UPLCMS /MS 60 120% 0,1121,74 àg/kg [12] 2012 [18] 2013 [37] 2014 [20] B vng Cú th nhn thy im chung ca cỏc phng phỏp QuEChERS l s dng cỏc k thut sc ký hin i nh GC -MS v c bit l LC- MS/ MS S d nh vy l do phng phỏp QuEChERS khụng cú s lm giu mu nờn cn phi hp vi cỏc k thut phõn tớch hin i, cú nhy tt Trong ú, LC- MS/ MS cho thy cú nhiu u im v tớnh c hiu,... ny ỏp dng i vi c t vi nm Mt s nghiờn cu c tng hp bng 1.11 Bng 1.11 Xỏc nh c t vi nm bng phng phỏp QuEChERS Nm Nn mu i tng phõn tớch Lm sch K thut thu hi LOQ 2012 Bng ngụ DON, ZEA, nivalenol, 15acetyl-fusarenon d-SPE (MgSO4 + C18) GC -MS 61118% 65-196 àg/kg Go 14 c t vi nm d-SPE (MgSO4, PSA, C18, nhụm trung tớnh) (UHPLC MS/ MS 70 98% 1,5-45 àg/kg Gia v 17 c t vi nm Khụng lm sch HPLC MS/ MS 75117% 2,3-146... 1.3.3 Phng phỏp LC- MS/ MS Sc kớ lng khi ph l mt k thut mi nhng ó c ng dng phõn tớch c t vi nm trờn nhiu i tng khỏc nhau do cú nhiu u im: 13 - Cú nhy cao, c bit l sc kớ lng khi ph hai ln (LC- MS/ MS) rt phự hp phõn tớch cỏc mu cú hm lng c t vi nm mc thp - Cú kh nng tỏch cỏc cht da theo m/z, do ú cựng vi kh nng tỏch cỏc cht nh HPLC thỡ phng phỏp ny cú kh nng phõn tớch ng thi nhiu c t vi nm trong cựng mt... T-2 toxin HT-2 ACN H20 AA Khụng lm sch (79:20:1) UPLCMS /MS 83,5107,3% 0,01 - 25 ng/g DON, ZEA, T-2toxin v cỏc cht chuyn húa ACN H20 AA (79:20:1), Khụng lm sch loi bộo bng nhexan LCMS /MS 80 110% 5 -13 ng/g [33] 2012 i tng Ng cc [9] ACN H20 (84:16) SPE -Oasisđ HLB column LC/ ESI 64-114% MS/ MS 0,1 59,2 àg/kg 1.3.2 Phng phỏp QuEChERS QuEChERS l tờn vit tt ca Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged v Safe... (84:16) Ct MycoSepđ #226 K thut thu hi LOD GC -MS 81-94% 5-10 ng/g LC APCI MS/ MS 50-99% 0,3-3,8 àg/kg 51% 124% 0,5-100 àg/kg ACN DON, ZEA v cỏc Khụng tỡm c LCESIH20 AA cht chuyn húa ct thớch hp MSMS (79:20:1) 11 Nm 2010 [28] 2011 [19] 2012 Nn mu Ng cc, thc phm tr em DON, ZEA, T-2, HT-2 Dung mụi chit Lm sch MeOHH20 (4:1) IAC K thut thu hi LOD LC 10 60100% MS/ MS 60àg/kg Thc phm t ng cc Aflatoxins, ochratoxin... trũ trong nguyờn nhõn ca bnh ung th vỳ ngi [41] Hn na, ZEA ó c tỡm thy trong cỏc mụ ni mc t cung ca ph n b ung th tuyn v trong mt s trng hp tng sn ni mc t cung Gia nm 1978 v 1981, ngi ta nghi ng rng ZEA mt trong nhng tỏc nhõn gõy bnh dy thỡ sm Puerto Rico [30] 1.1.3 Gii hn ụ nhim DON v ZEA trong thc phm [2] 1.1.3.1 Gii hn cho phộp deoxynivalenol trong thc phm Bng 1.1 Gii hn ụ nhim deoxynivalenol trong. .. lng c t vi nm DON v ZEA trong thc phm Cú rt nhiu nghiờn cu khỏc nhau v hm lng c t vi nm c bit l DON v ZEA trong thc phm trờn th gii Theo bỏo cỏo t SCOOP (Scientific Co-operation on Questions relating to Food) mc 3.2.10 D liu tng hp s cú mt ca c t vi nm do Fusarium trong thc phm v ỏnh giỏ ch n hng ngy ti cỏc nc thnh vi n liờn minh chõu u [31] ti 11 nc, trong tng s 11022 mu cú 57 % mu dng tớnh vi DON... (NP-HPLC) v sc kớ pha o (RP-HPLC) - Sc kớ pha thun: pha tnh cú b mt l cỏc cht phõn cc (ú l cỏc silica trn hoc cỏc silica c gn cỏc nhúm alkyl cú ớt cacbon mang cỏc nhúm chc phõn cc: -NH2, -CN) - Sc kớ pha o: pha tnh thng l cỏc silica ó c alkyl húa, khụng phõn cc, loi thụng dng nht l C18H37 14 b Pha ng trong HPLC [1][3] Pha ng trong HPLC úng gúp mt phn rt quan trng trong vic tỏch cỏc cht phõn tớch trong. .. I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 Nguyờn vt liu, thit b 2.1.1 i tng nghiờn cu 2.1.1.1 c t vi nm i tng nghiờn cu l 2 c t vi nm deoxynivalenol (DON) v zearalenone (ZEA) Bng 2.1 Cỏc c t vi nm c s dng trong nghiờn cu Cụng thc phõn Khi lng phõn t t DON C15H20O6 296 ZEA C18H22O5 318 TT c t vi nm Ký hiu 1 Deoxynivalenol 2 Zearalenone 2.1.1.2 i tng phõn tớch i tng mu c la chn xỏc nhn giỏ tr s dng ca phng phỏp . độc tố mà chƣa xác định đồng thời đƣợc chúng. Với lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: Xác định đồng thời độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone trong một số sản phẩm thực phẩm bằng. HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐOÀN THỊ THẢO XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM DEOXYNIVALENOL VÀ ZEARALENONE TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC PHẨM BẰNG LC- MS/ MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng. DƢỢC HÀ NỘI ĐOÀN THỊ THẢO XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM DEOXYNIVALENOL VÀ ZEARALENONE TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC PHẨM BẰNG LC- MS/ MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI