GC- MS
Để đảm bảo phương pháp phân tắch định lượng đã xây dựng đạt yêu cầu
ứng dụng phân tắch thực tế thì phương pháp đó cần phải được thẩm định với những tiêu chắ như: độđúng, độ chắnh xác, tắnh chọn lọc, giới hạn định lượng, khoảng nồng độ tuyến tắnh, độ thu hồi [10], [29].
2.3.3.1. Tắnh phù hợp của hệ thống GC-MS
Tắnh phù hợp của hệ thống được xác định bằng cách tiêm 5 lần một mẫu chứa 6-MAM chuẩn trong nước tiểu đã được xử lý theo điều kiện sắc ký khắ
đã lựa chọn. Xác định RSD của các thông số: thời gian lưu, diện tắch pic (không lớn hơn 2%) và tỷ số diện tắch pic chất phân tắch/ diện tắch pic nội chuẩn
2.3.3.2. Tắnh chọn lọc, đặc hiệu
Tắnh chọn lọc nói lên khả năng xác định đúng chất phân tắch khi có mặt các tạp chất hoặc chất khác. Xác định tắnh chọn lọc bằng cách phân tắch các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm chất chuẩn.
Trong sắc ký khắ khối phổ có thể xác định tắnh chọn lọc, đặc hiệu thông qua thư viện phổ chuẩn của 6-MAM. Dựa vào các mảnh phổ có thể xác định sự có mặt của 6-MAM.
2.3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện LOD (limit of detection) là nồng độ thấp nhất của chất phân tắch có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng
được trong điều kiện thắ nghiệm cụ thể. Trong sắc ký khắ LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tắch mà tại đó tỉ lệ giữa tắn hiệu của chất phân tắch và tắn hiệu nền bằng 3 (S/N=3).
Giới hạn định lượng LOQ (Limit of Quantification) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn. LOQ trong nhiều trường hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tắnh.
Có nhiều cách xác định LOQ dựa vào độ lệch chuẩn, tắn hiệu trên nhiễu, dựa trên đường chuẩn. Thường chấp nhận giới hạn định lượng bằng 10 lần độ
lệch chuẩn hoặc được xác định là nồng độ mà tại đó tỉ lệ giữa tắn hiệu của chất phân tắch và tắn hiệu nền bằng 10 (S/N =10).
2.3.3.4. Khoảng nồng độ tuyến tắnh
Khoảng tuyến tắnh của một phương pháp phân tắch là khoảng nồng độ, ở đó có sự phụ thuộc tuyến tắnh giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tắch. Việc xác định khoảng tuyến tắnh thường được khảo sát từ giới hạn định lượng đến giới hạn tuyến tắnh. Để xác định cần tối thiểu 5 nồng độ khác nhau. Chuẩn bị mẫu là các mẫu nước tiểu trắng, pha chuẩn 6-MAM ở các nồng
độ khác nhau (làm tối thiểu 5 nồng độ, mỗi nồng độ 6 lần). Vẽ đường tuyến tắnh phụ thuộc giữa tỷ lệ tắn hiệu đo và nồng độ.
Xây dựng phương trình hồi quy (y = ax + b)
Trong đó: y là tỉ lệ diện tắch pic chất phân tắch/diện tắch pic nội chuẩn x là nồng độ chất khảo sát
Tắnh hệ số tương quan hồi quy R. Nếu R trong khoảng [0,995;1] thì có tương quan tuyến tắnh rõ rệt.
Các thông số như LOD, LOQ có thể ước tắnh từ việc nghiên cứu đường chuẩn
2.3.3.5. Độđúng
Độ đúng của một phương pháp phân tắch là mức độ gần sát của kết quả
Để đánh giá độ đúng của phương pháp, chúng tôi tiến hành đánh giá qua hệ số thu hồi của phương pháp chiết dựa trên kỹ thuật thêm chuẩn vào mẫu đã biết trước hàm lượng. Tiến hành phân tắch ở 3 mức nồng độ khác nhau (nồng độ cao, nồng độ trung bình và nồng độ thấp của đường chuẩn). Tại mỗi mức thêm chuẩn, phân tắch lặp lại 3 lần, tiến hành ở 3 ngày liên tiếp khác nhau. Thắ nghiệm được tiến hành với các điều kiện hóa chất, thuốc thử
và thiết bị như nhau. Độ thu hồi của phương pháp được tắnh theo công thức sau:
(Cm+c Ờ Cm) x 100 R(%) =
Cc Trong đó:
Cm+c: Nồng 6-MAM trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ 6- MAM trong mẫu
Cc: Nồng độ chuẩn thêm
Yêu cầu giá trị trung bình thu được ở mỗi nồng độ phải sai không quá 15% (85-115%), riêng giá trị nồng độ tại LOQ cho phép giới hạn 20% (80- 120)
2.3.3.6. Độ chắnh xác
Độ chắnh xác của một phương pháp phân tắch là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tắch được áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất. Độ chắnh xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD%). Yêu cầu RSD % thu được phải không lớn hơn 15%, riêng tại nồng độ LOQ cho phép không vượt quá 20%.
Tiến hành phân tắch ở ắt nhất 3 mức nồng độ khác nhau (nồng độ cao, nồng độ trung bình và nồng độ thấp của đường chuẩn). Tại mỗi mức thêm chuẩn, phân tắch lặp lại 6 lần. Tắnh toán độ lệch chuẩn SD và hệ số biến sai RSD tắnh theo công thức sau:
100 (%) tb S SD RSD 1 ) ( 2 n S S SD i tb Trong đó: Si là diện tắch của pic sắc ký thứ i ; n là số lần chạy lặp lại Stb là diện tắch trung bình của n lần chạy 2.3.3.7. Độ thu hồi
Chuẩn bị 3 mẫu nước tiểu khảo sát, 3 mẫu nước tiểu so sánh ở 3 mức nồng độ thấp, giữa, cao (10ng/ml; 100ng/ml; 1000ng/ml). Mỗi mức nồng độ
tiến hành lặp lại với 3 mẫu khảo sát, 3 mẫu so sánh. Tắnh độ thu hồi bằng cách so sánh kết quả tỷ lệ diện tắch pic ở mẫu khảo sát, mẫu so sánh tương
ứng ở mỗi mức nồng độ