ẫn xuất hóa và phân tắch trên GC-MS - Thu mẫu
)
Dụng cụ đựng mẫu:Mẫu nước t kắn
Giám sát lấy mẫu: người giám sát thu mẫu phải trực tiếp (mặt đố
át trong suốt quá trình thu mẫu
Quan sát, đo các chỉ số hóa lý ban đầu: màu
Niêm phong, ghi nhãn và biên bản thu mẫu (theo mẫu quy định) Lượng mẫu thu: tối thiểu 5ml/phép phân tắch
- Bảo quản, vận chuyển tới phòng thắ nghiệm:
6-MAM trong mẫu nước tiểu bị phân hủy theo thời gian.
tắch mẫu ngay sau khi thu mẫu. Nếu nơi thu mẫu xa Phòng thắ nghiệm hoặc chưa
- Xử l uất hóa
Býớc 1- Lấy 5,0mL nýớc tiểu vào ống nghiệm sạch đã đánh số kắ hiệu, Chiết loại tạp bằng ether dầu hỏa cùng lýợng. Bỏ pha dung môi,
dung dịch NaOH 5%, kiểm tra pH bằng g
r khoảng 15 phút,
c 10- Hút pha dung môi cho qua phễu lọc chứa Na2SO4 khan, thu 4,5 mL
a nýớc đýợc chiết lại 2 lần bằng dung môi (býớc 7 đến býớc 1
30 phút
i PFPA dý bằng khắ nitõ ở nhiệt độ phòng
chuẩn octacosan uyển dung dịch sang lọ sắc ký (insert vial) để
ối phổ tứ cực GC
ý mẫu: Quy trình chiết lỏng-lỏng 6-MAM trong nước tiểu và dẫn x
Býớc 2- Acid hóa bằng dung dịch HCl 5%, kiểm tra pH khoảng 2-3 Býớc 3-
Býớc 4- Trung hòa dịch chiết bằng iấy quỳ
Býớc 5- Thêm NaHCO3 đến bão hòa, Býớc 6- Lắc đều và lọc (nếu cần),
Býớc 7- Thêm 5,0mL dung môi Chloroform/Isopropanol tỷ lệ 9/1, Býớc 8- Lắc ống nghiệm trên máy lắc shake
Býớc 9- Ly tâm 5 phút 3000vòng/phút để tách pha, Býớ
pha dung môi sang một ống nghiệm sạch, Býớc 11- Ph
0)
Býớc 12- Gộp 3 dung môi chiết và thổi khô dung môi bằng khắ nitõ trong lọ dẫn xuất,
Býớc 13- Thêm 50μl PFPA và dẫn xuất ở 65-700C trong
Býớc 14- Để nguội lọ dẫn xuất đến nhiệt độ phòng (nếu chýa phân tắch có thể bảo quản mẫu này trong khoảng 1 tháng)
Býớc 15- Đuổ
Býớc 16- Hòa tan cặn bằng 50μl dung dịch nội 40ng/ml trong ethylacetate, ch
phân tắch GC-MS.
- Phân tắch trên GC-MS: Sắc ký khắ ghép kh : - Thể tắch bõm mẫu: 1ìl
0,32nm ID x 0,25 ìm; ph
t: Nhiệt độ đầu 150oC giữ 1 phút, tãng lên phút. Tổng thời gian phân tắch là 23 phút. - Chế độ bõm: Không chia dòng (splitless)
- Nhiệt độ inlet: 270oC
- Cột tách: Cột mao quản HP5ms: kắch thýớc: 30m x a tĩnh: 5%phenyl-95%metyl-polysilosan.
- Khắ mang: heli. Tốc độ dòng khắ mang: 1,5ml/phút - Chýõng trình nhiệt độ lò Ờ cộ
270oC với tốc độ 10oC/phút và giữ 10 MS: Nhiệt độ transfer line: 2700C Nhiệt độ ion sourser: 2300C
c. , 414, 361)
lượng 6-MAM trong nước tiểu bằng
3.2.1.
u mẫu. Mẫu đýợc t
độ 500ng/ml) trýớc khi dẫn xuất. Sau đó bõm lặp lại 5 lần trên GC-MS ở chế độ Full scan và SIM (6-MAM-PFP: 473, 414
Kiểu tạo ion: va chạm điện tử EI. Thế bắn phá: 70eV Sàng lọc ion: bộ tứ cự
Chế độ quét: Full scan 40-600m/z. SIM: 6-MAM (327, 268, 215), 6- MAM-PFP (473 3.2. Thẩm định phương pháp định GC-MS Khảo sát tắnh chọn lọc, đặc hiệu Cách tiến hành: Tắnh đặc hiệu đýợc xác định bằng cách lấy 10 mẫu nýớc tiểu của 10 ngýời khỏe mạnh không sử dụng ma túy, không sử dụng các thuốc chứa hoạt chất nhóm opiat trong thời gian một tuần tắnh đến thời điểm th
hu theo đúng quy trình thu mẫu và xử lý theo phýõng pháp đã xây dựng
ở trên. Sau đó phân tắch trên GC-MS theo chế độ quét full scan.
Mẫu nýớc tiểu trắng sau khi tách chiết theo quy trình đýợc thêm chất chuẩn 6-MAM (đạt nồng
, 361 và Octacosan: 71, 85, 393)
Kết quả:
Nhận diện 6-MAM-PFP trên phổ đồ thông qua thời gian lýu và khối phổ đồ so với thý viện phổ khối. Kết quả ghi ở bảng 3.5 cho thấy: độ lệch chuẩn týõng đối của giá trị thời gian lýu tuyệt đối của 6-MAM-PFP (RSDt = 0,13%) và độ lệch chuẩn týõng đối của giá trị thời gian lýu týõng đối của 6- MAM-PFP so với nội chuẩn (RSDtRel= 0,11%) đều nhỏ hõn 1%, chứng tỏ hệ
thống GC-MS phù hợp để phân tắch nhận dạng 6-MAM-PFP. Pic tại vị trắ thời gian lýu 10,69 phút cho phổ khối lýợng full scan týõng thắch với dữ liệu các mảnh phù hợp để phân tắch định lýợng 6- MAM ng 3 m/z củ iệu, chọn lọc để phân tắch định tắnh, định lýợng 6-MAM trong mẫu nýớc tiểu
phổ từ tài liệu phổ càng khẳng định chắc chắn sự có mặt 6-MAM-PFP.
Ở chế độ quét SIM cho độ lệch chuẩn týõng đối của giá trị tỷ lệ diện tắch pic 6-MAM-PFP so với nội chuẩn (RSDSrel= 0,54%) nhỏ hõn 2%, chứng tỏ hệ thống GC-MS (chế độ quét SIM)
-PFP theo phýõng pháp nội chuẩn
Kết quả phân tắch 10 mẫu nýớc tiểu trắng cho thấy: tại vị trắ thời gian lýu 10,6 Ờ 10,8 phút không thấy sự xuất hiện của pic đáng kể nào, đặc biệt tại vị trắ đó trên cả 10 phổ đồ của 10 mẫu đều không cho các mảnh m/z giố
a 6-MAM-PFP đã chọn. Kết quả týõng tự với pic chất nội chuẩn. Kết luận: Phýõng pháp phân tắch đã lựa chọn đảm bảo tắnh đặc h
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tắnh phù hợp của hệ thống Thời gian lýu (chế độ full scan)
t6-MAM-PFP (phút) tIS (phút) t6-MAM-PFP/tIS Tỷ lệ diện tắch pic S6-MAM-PFP/ SIS (chếđộ SIM) Lần 1 10,678 13,547 0,788219 5,298344 Lần 2 10,689 13,574 0,787461 5,322989 Lần 3 10,712 13,563 0,789796 5,330121 Lần 4 10,691 13,556 0,788654 5,340101 Lần 5 10,704 13,584 0,787986 5,377508 Trung bình 10,6948 13,5648 0,7884232 5,3338126 SD 0,01333 0,01458 0,00088 0,0288861 RSD % 0,13 0,11 0,11 0,54
3.2.2 Đường chuẩn, khoảng làm việc, Giới hạn phát hiện (LOD) , ngưỡng phát hiện (Cut off) phát hiện (Cut off)
Cách tiến hành: Mẫu nước tiểu trắng được tách chiết theo quy trình đã xây dựng để tạo nền phân tắch, thu được 30 mẫu trắng. Thêm 6-MAM từ dung dịch gốc vào các mẫu trắng này tạo thành 5 điểm chuẩn có nồng độ 6-MAM như sau: 5ng/ml, 40ng/ml, 200ng/ml, 500ng/ml, 1000ng/ml. Mỗi điểm chuẩn làm 6 mẫu. Sau đó tiến hành dẫn xuất hóa và phân tắch trên GC-MS chế độ
SIM theo quy trình. Tắnh tỷ lệ diện tắch pic của 6-MAM-PFP so với diện tắch pic chất nội chuẩn ở mỗi điểm chuẩn bằng giá trị trung bình 6 mẫu của điểm chuẩn đó.
Kết quả: Kết quả được xử lý thống kê ghi ở bảng 3.6 và xây dựng đồ
thịđường chuẩn định lượng (hình 3.13)
Từ độ lệch chuẩn tắn hiệu thấp nhất và độ dốc đường chuẩn định lượng, ta tắnh được giá trị giới hạn phát hiện của thiết bị đối với 6-MAM-PFP là LODGC-MS/6-MAM-PFP = 0,514 ng/ml
Từ kết quả hiệu xuất chiết 3 lần 6MAM là 82,9%, ngoại suy ngưỡng phát hiện của phương pháp là 6,2 ng/lắt nước tiểu.
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát xây dựng đường chuẩn, xác định LOD, LOQ Tỷ lệ diện tắch pic S6-MAM-PFP/ SISở các mức nồng độ 5ng/ml 40ng/ml 200ng/ml 500ng/ml 1000ng/ml Lần 1 0,160010 0,512422 2,194231 5,161027 9,969743 Lần 2 0,121157 0,507454 2,544653 5,333861 10,410434 Lần 3 0,098799 0,480177 1,966264 4,97202 10,369655 Lần 4 0,131307 0,490851 2,599774 5,000643 11,000321 Lần 5 0,100116 0,574003 2,589331 4,901873 9,697816 Lần 6 0,150121 0,599502 2,283236 5,967677 11,015341 Trung bình 0,1269183 0,5274015 2,36291475 5,222850167 10,41055167 SD 0,02528 0,04808 0,257888 0,396543 0,5324613 RSD % 19,92 9,12 10,91 7,59 5,11
Đồ thịđường chuẩn định lượng y = 0.0103x + 0.1476 R2 = 0.9995 0 2 4 6 8 10 12 0 200 400 600 800 1000 1200 Nồng độ mẫu (ng/ml) T ỷ l ệ di ệ n t ắc h pi c
Hình 3.12: Đồ thịđường chuẩn định lượng
3.2.3. Độ đúng
- Cách tiến hành: lấy dung dịch chuẩn 6-MAM pha vào cặn mẫu
nước tiểu trắng đã được chiết xuất theo quy trình để đạt được các điểm nồng độ 10ng/ml; 500ng/ml; 1000ng/ml tiến hành dẫn xuất và phân tắch GC-MS theo quy trình. Song song tiến hành dẫn xuất mẫu chuẩn 6- MAM. Mỗi nồng độ làm 3 mẫu lấy kết quả trung bình. Thắ nghiệm
được lặp lại ở 3 ngày liên tiếp khác nhau,
- Kết quả: kết quả cho ở bảng 3.7 cho thấy:
+ Tất cả các mẫu đều cho pic ở chế độ quét full scan có phổ khối lượng nhận dạng phù hợp với phổ chất chuẩn dẫn xuất 6-MAM ở thời gian lưu 10,69 phút
+ Kết quả phân tắch các mẫu ở mỗi nồng độ trong các ngày khác nhau là khác nhau. Tuy nhiên, sự sai khác không nhiều: ở nồng độ thấp 10ng/ml sai khác dao động -12,4% đến +9,2% so với giá trị trung bình
được kỳ vọng; ở nồng độ trung bình 500ng/ml giá trị sai khác dao động -7,12% đến +5,05% so với giá trị trung bình được kỳ vọng; ở nồng độ
cao 1000ng/ml giá trị sai khác dao động -4,51% đến +7,95% so với giá trị trung bình được kỳ vọng.
- Kết luận: phương pháp cho độ đúng đảm bảo để định lượng 6- MAM trong mẫu nước tiểu
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát xác định độđúng Điểm nồng độ 10ng/ml Điểm nồng độ 500ng/ml Điểm nồng độ 1000ng/ml S6-MAM- PFP/SIS % sai khác S6-MAM- PFP/SIS % sai khác S6-MAM- PFP/SIS % sai khác Ngày thứ 1 0,2194 - 12,4 5,563837 + 5,05 9,9787145 - 4,51 Ngày thứ 2 0,25847 + 3,2 4,919268 - 7,12 10,09053 - 3,44 Ngày thứ 3 0,2735 + 9,2 5,406005 + 2,07 11,280786 + 7,95 Trung bình 0,25046 5,29637 10,45001
Ghi chú: trong cột % sai khác: dấu Ộ-Ộ là sai khác thiếu và Ộ+Ợ là sai khác hơn so với kỳ vọng
3.2.4. Độ chắnh xác
- Cách tiến hành: Độ chắnh xác của phýõng pháp đýợc xác định
cách thêm dung dịch chuẩn 6-MAM vào cặn chiết nýớc tiểu trắng để đạt đýợc các mức nồng độ 5ng/ml, 40ng/ml, 200ng/ml, 500ng/ml, 1000ng/ml) phân tắch theo quy trình đã chọn
- Kết quả và kết luận: so sánh các kết quả ở mỗi mức nồng độ,
tắnh RSD% (xem bảng 3.6). Ở mức nồng độ thấp (5ng/ml) giá trị RSD = 19,9%, các mức nồng độ cao hơn còn lại giá trị RSD dao động trong khoảng 5,1-10,9%. Như vậy, phương pháp cho độ chắnh xác đảm bảo để định lượng 6-MAM trong mẫu nước tiểu
3.2.5. Độ thu hồi
- Cách tiến hành:
+ Dung môi chiết mẫu: Pha chất nội chuẩn octacosan từ dung dịch nội chuẩn gốc vào dung môi chiết (chloroform/isopropanol: 9/1)
để đạt được nồng độ 2ng/15ml (tương đương 133,33ng/lắt);
+ Mẫu nước tiểu khảo sát: thêm 6-MAM từ dung dịch chuẩn gốc 6-MAM vào mẫu nước tiểu trắng để có được nước tiểu khảo sát ở 3 mức: nồng độ thấp 0,1 μg/lắt; nồng độ giữa 1 μg/lắt; nồng độ cao 10
μg/lắt;
- Mẫu so sánh:
+ Pha các mức nồng độ: nồng độ thấp: 10ng/ml 6-MAM, 2ng/ml IS; nồng độ giữa: 100ng/ml 6-MAM, 2ng/ml IS; nồng độ cao: 1000ng/ml 6-MAM, 2ng/ml IS;
+ Dẫn xuất: lấy 50μl mẫu đã pha ở mỗi mức nồng độ vào cặn mẫu nước tiểu trắng (chuẩn bị từ 5ml nước tiểu trắng) thổi khô bằng khắ nitơ rồi dẫn xuất hóa với 50μl chất dẫn xuất PFPA. Sau khi đuổi PFPA dư, cặn được hòa tan bằng 50μl etylacetat để phân tắch trên GC-MS theo quy trình.
Mỗi mức nồng độ tiến hành lặp lại với 3 mẫu khảo sát, Mẫu so sánh tỷ lệ diện tắch lấy trung bình 3 lần được coi là 100%
- Kết quả: + Tắnh độ thu hồi (%) bằng cách so sánh kết quả tỷ lệ diện tắch pic ở mẫu khảo sát và mẫu so sánh tương ứng với mỗi mức nồng độ. Kết quả được ghi ở bảng 3.8 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp Mức nồng độ 10ng/ml Mức nồng độ 100ng/ml Mức nồng độ 1000ng/ml
S6-MAM-PFP/SIS S6-MAM-PFP/SIS S6-MAM-PFP/SIS
Mẫu số Khảo sát Sosánh HTH % Khảo sát Sosánh HTH % Khảo sát Sosánh HTH % 1 0,23314 0,2515 92,7 1,06696 1,1842 90,1 10,7009 10,4399 102,5 2 0,28168 0,2515 112 1,03262 1,1842 87,2 9,47943 10,4399 90,8 3 0,21639 0,2515 86,04 1,14038 1,1842 96,3 9,90746 10,4399 94,9
- Kết luận: phương pháp cho tỷ lệ thu hồi 86-112% ở nồng độ thấp; 87-96% ở nồng độ giữa và 91-102% ở nồng độ cao
3.3. Ứng dụng phương pháp phân tắch mẫu thực tế
Lựa chọn 8 mẫu nước tiểu của các đối tượng nghi ngờ có sử dụng ma túy được các cơ quan thu và yêu cầu phân tắch.
Trong đó, có 01 mẫu người nhà nghi ngờ và tự thu chuyển đến yêu cầu phân tắch (M01); 02 mẫu cơ quan quản lý đối tượng nghi ngờ vì có đơn thư tố
giác sử dụng ma túy, đã dẫn đến trung tâm để thu mẫu và phân tắch (M02, M03); 05 mẫu cơ quan điều tra thu của 05 đối tượng trong nhóm tổ chức sử
dụng (M04 đến M08). Kết quả sàng lọc ban đầu về mẫu: 8 mẫu đều có kết quả dương tắnh với que thử miễn dịch nhóm opiat (que thử morphin), trong đó 02 mẫu không rõ ràng. Có 2 mẫu (M02, M03). Các chỉ tiêu hóa lý và cảm quan đều đạt yêu cầu (bảng 3.9)
Các mẫu được mã hóa và tiến hành phân tắch theo quy trình đã chọn. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.10 và hình 3.13.
Bước đầu ứng dụng quy trình nghiên cứu vào thực tiễn cho kết quả khả
quan (nồng độ 6-MAM trong nước tiểu được tìm thấy 48 Ờ 204ng/ml), được kiểm chứng thực tiễn, chứng tỏ quy trình đã đạt được mục tiêu đề ra.
Bảng 3.9: Một số thông tin ban đầu về mẫu nước tiểu thực tế
Tên mẫu Cảm quan Thuốc dùng trong 1 tuần gần đây KQ que thử morphin pH/giấy quỳ Mẫu M01 trong, màu vàng Không + 6,5-7,5 Mẫu M02 trong, màu vàng Thuốc ho + 6,5-7,5 Mẫu M03 trong, màu vàng thuốc ho + 6,5-7,5 Mẫu M04 trong, màu vàng Không + 6,5-7,5 Mẫu M05 trong, màu vàng Không + 6,5-7,5 Mẫu M06 trong, không màu Không + 6,5-7,5 Mẫu M07 trong, màu vàng Không + (không rõ) 6,5-7,5 Mẫu M08 trong, không màu Không + (không rõ) 6,5-7,5
Bảng 3.10: Kết quả phân tắch mẫu thực tế
Tên mẫu Kết quả phân tắch Nồng độ 6-
MAM
Mẫu M01
Không tìm thấy các chất ma túy nhóm opiat và sản phẩm chuyển hóa của chúng trong mẫu
nước tiểu gửi phân tắch
< 6,2ng/l nước tiểu
(<0,51ng/ml)
Mẫu M02
Có thấy Morphin, Codein nhưng không tìm thấy
6-MAM
< 6,2ng/l nước tiểu
(<0,51ng/ml)
Mẫu M03 Có thấy Morphin, Codein, 6-MAM 0,58ộg/l nước tiểu
(48ng/ml)
Mẫu M04 Có thấy Morphin, 6-MAM 2,45ộg/l nước tiểu
(203 ng/ml)
Mẫu M05 Có thấy Morphin, 6-MAM 2,37ộg/l nước tiểu
(197 ng/ml)
Mẫu M06 Có thấy Morphin, 6-MAM 2,46ộg/l nước tiểu
(204 ng/ml)
Mẫu M07
Không tìm thấy các chất ma túy nhóm opiat và sản phẩm chuyển hóa của chúng trong mẫu
nước tiểu gửi phân tắch
< 6,2ng/l nước tiểu (<0,51ng/ml)
Mẫu M08 Có thấy Morphin, 6-MAM 1,53ộg/l nước tiểu
Hình 3.13: Phổ đồ kết quả phân tắch của mẫu M03
(a) Phổđồ GC M03;
(b) Khối phổ đồ Morphin(PFP)2 ứng với pic 9,78phút; (c) Khối phổđồ 6-MAM-PFP ứng với pic 10,71phút; (d): khối phổ đồ codein-PFP ứng với pic 10,13phút
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1 Về thẩm định phương pháp phân tắch 6-MAM trong nước tiểu
Để đảm bảo phương pháp phân tắch 6-MAM trong nước tiểu đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tắch thực tế thì các đặc điểm phân tắch đặc trưng cần được thẩm định theo quy định chung về thẩm định phương pháp phân tắch dịch sinh học, và theo hướng dẫn của cơ quan phòng chống ma túy và tội phạm của Liên hợp quốc.
Qua kết quả khảo sát tắnh chọn lọc, đặc hiệu của 6-MAM đối với sắc ký khắ Ờ khối phổ cho thấy các thông số phân tắch đều có RSD nhỏ hơn 2% chứng tỏ hệ thống GC-MS phù hợp để phân tắch định tắnh, định lượng 6-