nước tiểu
Sau khi lựa chọn được dung môi chiết, khảo sát hiệu suất chiết một lần 6-MAM trong mẫu nước tiểu phụ thuộc vào pH mẫu được tiến hành. Môi trường chiết xuất là một trong những yếu tố quan trọng quyết định hiệu suất của quá trình chiết. Đối với 6-MAM là alcaloid trong phân tử chứa nhóm amin bậc ba, khoảng pH cần chiết xuất là pH kiềm.
Chuẩn bị mẫu và tiến hành phân tắch
Để có các điểm pH khác nhau, các dung dịch đệm phosphat có pH trong khoảng 7ọ11 được sử dụng và quá trình khảo sát được tiến hành theo các bước sau:
Býớc 1- Lấy vào 5 ống nghiệm sạch đã đánh số, mỗi ống 5,0mL nýớc tiểu khảo sát,
Býớc 2- Acid hóa bằng dung dịch HCl 5%, kiểm tra pH khoảng 2-3 Býớc 3- Chiết loại tạp bằng ether dầu hỏa cùng lýợng. Bỏ pha dung môi,
Býớc 4- Trung hòa dịch chiết bằng dung dịch NaOH 5%, Býớc 5- Thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch đệm,
Býớc 6- Lắc đều và kiểm tra pH ở mỗi ống nghiệm bằng giấy quỳ, Býớc 7- Thêm vào mỗi ống nghiệm 5,0mL dung môi
Chloroform/Isopropanol tỷ lệ 9/1,
Býớc 8- Lắc các ống nghiệm trên máy lắc shaker khoảng 15 phút, Býớc 9- Ly tâm 5 phút 3000vòng/phút để tách pha,
Býớc 10- Hút pha dung môi cho qua phễu lọc chứa Na2SO4 khan, thu 4,5 mL pha dung môi sang một ống nghiệm sạch,
Býớc 11- Thổi khô dung môi bằng khắ nitõ,
Býớc 12- Hòa tan cặn bằng 50μl dung dịch nội chuẩn, chuyển dung dịch sang lọ sắc ký (insert vial) để phân tắch theo CTSK GC-FID.
Mỗi điểm pH thắ nghiệm ở trên được lặp lại 3 lần, phân tắch trên GC-FID, tắnh tỷ lệ diện tắch pic 6-MAM và diện tắch pic chất nội chuẩn tương ứng và lấy kết quả trung bình.
Kết qủa khảo sát pH môi trường chiết
Kết quả khảo sát pH chiết cho ở hình 3.5; 3.6 và bảng 3.2
Bảng 3.2: Kết quả khả năng chiết 6-MAM trong nước tiểu phụ thuộc vào pH mẫu S6-MAM/ SIS pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11 Lần 1 - 0,529 0,68 0,231 - Lần 2 - 0,589 0,711 0,404 - Lần 3 - 0,454 0,683 0,354 - Trung bình 0,524 0,691 0,330 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 T ỷ l ệ di ệ n tắ ch p ic 6M A M và I S pH 8 pH 9 pH 10
Khả năng chiết 6MAM ở các môi trường pH
Hình 3.5: Đồ thị biểu thị khả năng chiết 6-MAM trong nước tiểu ở các giá trị pH
Hình 3.6: Phổ đồ GC của mẫu chiết với chloroform ở pH=9
Tại pH từ 8 đến 9 cho hiệu suất chiết tốt nhất so với khoảng pH được khảo sát, đặc biệt với pH=9. Tham khảo các tài liệu của UNODC, pH thông dung nhất trong quá trình khảo sát là tại 8,5, đây cũng là khoảng pH được khảo sát trong suốt quá trình tiến hành đề tài.
Đểđạt được giá trị pH như mong muốn ta thường dùng các hệđệm photphate, ammonium hoặc có thể sử dụng muối NaHCO3 (pha muối này đến bão hòa thì đạt được pH khoảng 8,5).